LncRNA 1700020I14Rik调控心脏成纤维细胞活化增殖和纤维化的实验研究

蔡 磊，尹春颖，尹德春

心力衰竭是全球疾病导致死亡的主要原因，其特点是因危险因素而导致心脏结构和功能受损[1]。尤其是舒张功能障碍已经被认为是心力衰竭的主要机制，其主要原因是心脏纤维化[2]。随着心肌成纤维细胞的激活和增殖，细胞外基质(如胶原)的沉积增加，破坏了心肌结构，反过来又导致心脏结构顺应性差，从而阻碍正常的心排血量[3]。心肌纤维化的机制已被深入研究。其中，转化生长因子-β(TGF-β)是心肌纤维化过程中在成纤维细胞活化和增殖中起关键作用的细胞因子[4]。长链非编码RNA(LncRNA)是长度大于200个核苷酸的RNA，没有编码蛋白质的能力[5]。揭示了LncRNA在心脏发育和疾病中的新作用[6]。Fendrr是新发现的LncRNA，通过控制组蛋白H3K27乙酰化来调节心脏的发育[7]。“勇敢的心”中，已显示出心血管谱系中需要LncRNA表达[8]。Wisper富含心肌成纤维细胞的LncRNA并调节心脏成纤维细胞增殖[9]。GAS5拮抗微小RAN-21介导的心肌纤维化进展[10]。H19抑制DUSP5来促进心肌成纤维细胞增殖和纤维化[11]。这些研究表明，LncRNAs是心肌纤维化的重要调节因子。本研究发现一个保守的LncRNA 1700020I14Rik，其在心脏组织中选择性表达，并且在与纤维化相关的应激心脏中受到抑制。LncRNA的过度表达抑制新分离的心脏成纤维细胞增殖和胶原合成，表明发现了一个新的心肌病心肌纤维化的靶点。

1 材料与方法

1.1 实验动物 实验动物选购自哈尔滨医科大学动物实验基地。所有动物手术均经哈尔滨医科大学伦理委员会和大庆龙南医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 主动脉横带的制作 选择成年SD雄性小鼠(12周)用于手术。用呼吸机麻醉和插管后，给小鼠行胸骨中线肌切开术显露主动脉，用6-0丙烯缝合线将头臂动脉远端的主动脉与邻近主动脉放置的27号钝针捆绑在一起，然后将结拧紧，小心地取出针，用可吸收缝线缝合胸部的皮肤闭合。术后1周采集心脏标本。

1.2.2 心肌细胞分离 采用LangordFF灌流系统进行分离。先给小鼠注射100 U肝素，然后杀死小鼠取出整个心脏。将心脏连接到套管，用无钙灌注缓冲液灌注(113 mmol/L氯化钠，4.7 mmol/L氯化钾，0.6 mmol/L磷酸二氢钾，0.6 mmol/L磷酸氢二钠，1.2 mmol/L硫酸镁，10 mmol/L羟乙基哌嗪乙磺酸钠，12 mmol/L碳酸氢钠，10 mmol/L碳酸氢钾，0.032 mmol/L苯酚红，30 mmol/L牛磺酸，10 mmol/L二苯甲烷双马来酰亚胺和5.5 mmol/L葡萄糖)。再用消化缓冲液(Ⅱ型胶原酶300 U/mL灌注缓冲液，50 μmol/L CaCl2)灌注心脏10～12 min，然后用镊子将心脏分离以释放细胞。将细胞悬液在20重力下离心3 min，收集心肌细胞。将悬浮液用CD31偶联磁珠收集内皮细胞，收集出的样本作为原代成纤维细胞进行电镀。

1.2.3 5-乙炔基-2′-脱氧尿嘧啶核苷(EdU)细胞增殖检测 根据EdU说明书使用iT EdU细胞增殖试剂盒进行可视化。在每个田格(20×)中测定EdU阳性细胞。

1.2.4 细胞增殖试验 在96孔培养板的每个孔中镀入心脏成纤维细胞。在培养基中加入20 μL 10 mg/mL噻唑蓝细胞培养基。在细胞培养箱中培养2 h后，除去噻唑蓝溶液，然后向井中加入100 μL二甲基亚砜，在室温下溶解沉淀物10 min。使用PrimaMax M2微板阅读器(分子器件)在540 nm处记录吸光度。

1.2.5 实时定量PCR(quantitative reverse transcription PCR，qRT-PCR) 测定 RNA通过Trizol试剂(Invitrogen公司)分离，并根据制造商的指示用PrimeScript RT Master Mix(Clontech)进行互补DNA(cDNA)合成。根据制造商的说明(Roche)，使用SYBR Green PCR母体混合物，使用StepOne/StepOnePlusTM实时PCR系统(应用生物系统)测定转录水平。引物序列如下，1700020I14Rik：GGGACAATGCTCACCCTGAA和TCCAACCCAGTCACTGC；肌球蛋白重链6(Myh6)：GCCCAGTACCTCCGAAAGTC和GCCTTAACATACTCCTCCTTGTC；肌球蛋白重链7(Myh7)：ACTGTCAACACTAAGAGGGTCA和TTGGATGATTTGATCTTCCAGGG；肌浆网钙ATP酶2a(Serca2a)：GAGAACGCTCACACAAAGACC和CAATTCGTTGGAGCCCCAT；脑钠肽(BNP)：GAGGTCACTCCTATCCTCTGG和GCCATTTCCTCCGACTTTTCTC；心钠素(ANP)：GCTTCCAGGCCATATTGGAG和GGGGGCATGACCTCATCTT；α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)：GTCCCAGACATCAGGGAGTAA和TCGGATACTTCAGCGTCAGGA；Ⅰ型胶原蛋白(Collagen Ⅰ)：GCTCCTCTTAGGGGCCACT和CCACGTCTCACCATTGGGG；基质金属蛋白酶-9(MMP-9)：CTGGACAGCCAGACACTAAAG和CTCGCGGCAAGTCTTCAGAG。

2 结 果

2.1 LncRNA 1700020I14Rik在心脏中富集情况 利用EnCODE数据库[12]，发现小鼠心脏中H3K4三甲基化高度富集，提示该基因是主动转录的。事实上，在这个区域的心脏样品中发现了作为LncRNA的转录产物1700020I14Rik(见图1A)。为了验证数据库结果，确定了其在心脏发育过程中的表达。LncRNA在胚胎心脏中低水平表达，在成年心脏中高表达。在成年小鼠的心脏中，LncRNA水平是胚胎心脏的8倍(见图1B)。其只在心脏中高度表达，而不是在肺、肝、肾和胸腺等其他组织中高表达(见图1C)。

与胚胎10 d比较，＊P<0.001；与心脏比较， #P<0.05。

2.2 LncRNA 1700020I14Rik在应激心脏中被抑制 本研究在成年雄性小鼠中应用横向主动脉带。ANP、BNP、Myh7升高，Myh6、Serca2a降低，这是心脏肥大的标志物[13-14](见图2A、图2B)。本研究发现在心脏中LncRNA的表达被带状抑制(见图2C)，提示LncRNA可能参与心脏重塑过程。本研究测定分离的心肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞中LncRNA水平，没有观察到心肌细胞和内皮细胞中LncRNA的下调。然而，LncRNA水平在成纤维细胞中下调(见图2D)。

与Sham组比较，＊P<0.05，#P<0.01，△P<0.001。

2.3 LncRNA 1700020I14RiK抑制心肌成纤维细胞增殖 在建立了病变心脏的表达变化后，检测其在心肌肥厚过程中的功能和机制。采用小鼠离体心脏成纤维细胞模型，将LncRNA的cDNA转染到细胞中，用TGF-β成功地诱导了心肌成纤维细胞增殖(见图3A)。相比之下，LncRNA过表达抑制了DNA合成，由成纤维细胞中的EdU掺入来表示(见图3A、图3B)。这一观察结果证实了受损的增殖(见图3C)。同样，成纤维细胞标志物α-SMA也被LncRNA过表达抑制(见图3D)。胶原蛋白也受到了LncRNA过表达的抑制(见图3E)。此外，TGF-β诱导的MMP-9也受到LncRNA过表达的抑制(见图3F)。表明LncRNA在心肌成纤维细胞激活和细胞外基质重塑中具有抑制作用。

与Vector组比较，＊P<0.01，#P<0.001。

3 讨 论

纤维化是心力衰竭病人心功能损害的主要原因，主要通过心肌成纤维细胞的激活和增殖介导。细胞自主性和非自主性机制如何激活心肌成纤维细胞，对于理解心力衰竭时的心脏重构至关重要[15]。本研究阐述了心脏应激使心肌成纤维细胞中一个新的LncRNA 1700020I14Rik减少。其在心肌成纤维细胞中的恢复表达抑制了成纤维细胞的增殖。在最近的研究中，已经揭示了LncRNA 1700020I14Rik在糖尿病肾病模型中的作用[16]。间质纤维化是糖尿病肾病中普遍存在的病理现象，伴有大量细胞外基质积聚[17]。在糖尿病肾病小鼠中也观察到LncRNA 1700020I14Rik下调[16]。提示LncRNA 1700020I14Rik参与的纤维化过程不仅仅局限于心脏纤维化。心脏纤维化遵循与肺、肝、皮肤和肾等其他器官类似的途径[18]。因此，LncRNA 1700020I14Rik还应参与发生于其他器官的纤维化。 LncRNAs通常控制相邻基因表达[19]。LncRNA 1700020I14Rik位于钙调神经磷酸酶样EF手蛋白1(Chp1)的下游，Chp1是钙调神经磷酸酶活性的抑制剂[20]。钙调神经磷酸酶主要促进心脏肥大和衰竭[21]，提示LncRNA 1700020I14Rik通过调节钙调神经磷酸酶活性与心力衰竭有关。但应进一步进行其细胞定位和附近基因表达的实验研究。研究还表明，LncRNA 1700020I14Rik具有海绵样作用，可抑制microRNA-34a-5p介导的HIF1α信号通路[16]。microRNA-34a确实促进心肌梗死期间的心肌纤维化。这些观察表明LncRNA 1700020I14Rik介导心肌纤维化的类似机制。

总之，本研究发现一种新的抑制心脏成纤维细胞增殖的LncRNA。其受心脏应激下调，提示在应激心脏重构过程中心肌成纤维细胞活化和增殖的新机制。

LncRNA 1700020I14Rik是一种心肌富集型LncRNA，在应激性心肌纤维化中表达下调。LncRNA 1700020I14Rik抑制心肌成纤维细胞增殖和胶原合成，表明其在抑制心肌纤维化中有一定作用。