肉制品中N-亚硝胺的危害、形成机制及乳酸菌对其控制效果的研究进展

刘雨萱，黄晓红，徐晔，牛淑慧，王艺伦，杨壹芳，肖子涵，余沁心，刘书亮，敖晓琳，陈姝娟，刘爱平，何利，杨勇

(四川农业大学 食品科学学院，四川 雅安，625014)

N-亚硝胺(nitrosamines, NAs)是由亚硝酰离子与胺类物质反应生成的一类致癌物质，广泛存在于烟草、化妆品、食品、橡胶制品等环境中。在食源性污染方面，该物质常见于腌肉、烤肉、咸鱼等肉类加工食品中。膳食摄入的硝酸盐、亚硝酸盐在体内都能被转换为N-亚硝胺[1]。越来越多的流行病学研究证明N-亚硝胺及其前体物质的摄入量同直肠癌、胃癌、食管癌等癌症的发病风险成正相关[2]，这引起了人们的高度关注。鉴于N-亚硝胺对人体危害较大，世界卫生组织将其列为高危致癌物，故进一步了解N-亚硝胺对保护人体健康、完善食品安全体系，推动食品卫生安全的健康发展具有积极意义。

传统的N-亚硝胺控制方法分为物理和化学方法，但这些方法控制效率较低，操作不易且可能带来不良的风味，逐渐不能满足人们的预期。近年来，越来越多的学者将目光投向更为有效的生物控制法。生物控制法是一种利用微生物降低N-亚硝胺含量的方法，通常采用清酒乳杆菌、弯曲乳杆菌、乳球菌等乳酸菌进行发酵，因其不仅能降低N-亚硝胺含量，还能协调肉制品风味、延长产品保质期、操作易于标准化等优点而逐渐受到国内外学者的关注。本文将对肉制品中N-亚硝胺的种类、毒性、市售肉制品及水产品中N-亚硝胺含量、形成方式及其控制方法进行综述，并将重点介绍乳酸菌对肉制品中N-亚硝胺的控制研究现状，有助于人们充分认识N-亚硝胺对健康的危害，了解市售常见肉制品和水产品中的N-亚硝胺的含量，明确N-亚硝胺形成的基本条件和转化途径，清楚乳酸菌发酵对N-亚硝胺的减除效果，同时也可以为进一步利用乳酸菌控制N-亚硝胺的机理研究提供参考。

1 肉类制品N-亚硝胺的阐述

1.1 肉类制品中N-亚硝胺的致癌毒性研究

对迄今已知的300余种N-亚硝胺化合物的研究，发现90%以上的N-亚硝胺皆具有致癌性、毒性[3]，并且该毒性可通过母婴血胎屏障，传递给胎儿。实验证明长时间小剂量或者一次性大剂量摄入N-亚硝胺类化合物都会引发癌症及肝损伤[4]。N-亚硝胺致癌机制在传统上被认为包括3个生物学过程，即:(1)N-亚硝胺在靶器官或靶细胞中活化为烷基化阳离子；(2)DNA烷基化造成遗传损伤并诱导修复；(3)DNA修复无效导致基因突变并引发癌症[1, 4]。近年来发现慢性炎症对癌症有关键作用，而N-亚硝胺能够激活炎症反应的信号通路，所以N-亚硝胺致癌还可能与炎症反应有关[5-6]。

虽然食品中天然存在的N-亚硝胺含量很少，但其含有丰富的前体物质，在满足条件的适宜环境下即可转化为N-亚硝胺类化合物[7]。研究发现肉制品中N-亚硝胺类化合物含量较高且研究较为深入的是N-二甲基亚硝胺、N-二乙基亚硝胺、N-二丙基亚硝胺、N-吡咯烷亚硝胺、N-呱啶烷亚硝胺[8]等。通过动物学实验证明，毒性最强的是N-二甲基亚硝胺，其半数致死量为58 mg/kg，具有急性和慢性肝毒性和肾毒性[9]。如果青少年一次性服用N-二甲基亚硝胺高于300 mg、成人一次性服用高于1 200 mg，则可导致死亡[10]。除此之外，挥发性N-亚硝胺中N-二乙基亚硝胺，也是有着较强的致癌活性物质之一[11]。

表1 常见N-亚硝胺种类分子式、结构式及半致死量

1.2 市场销售的肉类制品与水产品中的N-亚硝胺含有量

随着N-亚硝胺的毒性研究越来越多，各国对肉制品中N-亚硝胺残留量也越来越重视，国际上陆续发布了对N-亚硝胺的含量限定的标准。我国食药监局在GB 2762—2017《食品中污染物限量标准》规定，肉制品中N-二甲基亚硝胺物质限量为3.0 μg/kg，水产品中为4.0 μg/kg；加拿大食药监局规定N-二甲基亚硝胺的含量不得超过10 μg/kg；美国在食品药品中对N-亚硝胺限定，该物质含量同比不得超过10 μg/kg。

许多学者[12-18]对市面上的红肠等常见肉制品中N-亚硝胺含量进行了检测，结果如表2所示。

表2 市售原料肉、肉制品及水产品中N-亚硝胺含量 单位：μg/kg

N-亚硝胺含量在不同种类肉制品之间，因其原料肉富含的营养成分与比例的不同而存在着一定差异；同类肉制品中，受地域差异、制作方式、烹饪习惯等因素影响，也存在较大差异。

根据表2含量对比得出，同一个地区，不同种类的肉制品之间存在较大差异。余卫军[18]采用气相色谱-三重四极杆质谱法测定了市售咸鱼及市售腊肠中N-亚硝胺的含量，对比发现水产品中N-亚硝胺含量通常比禽肉制品中N-亚硝胺含量高，这是因为水产品富含较多的不饱和脂肪酸，其中的假亚硝基衍生物会在加热时释放亚硝基化合物N2O3。该化合物易与胺类物质反应生成N-亚硝胺[19]，造成N-亚硝胺的检测量升高。

对比王凯丽[12]、余卫军[18]对市售红肠与市售腊肠的实验结果发现，不同种类的肉制品中N-亚硝胺的含量因其制作工艺不同，存在一定差异。HERRMANN等[14]对比了丹麦和比利时的Salami香肠、培根、火腿中N-亚硝胺含量得出，同种肉制品受地域差异、饮食习惯等因素影响，也会存在一定差异。对比YURCHENKO等[15]、杨华等[16]的研究发现，同种肉制品中，不同部位的肉与不同的烹饪方式也对N-亚硝胺的含量有着较大的影响。

通过市售原料肉、肉制品及水产品中N-亚硝胺含量与食品卫生标准对比得出，目前国内外市面上的肉制品都存在部分样品中N-亚硝胺含量超标的现象。

1.3 肉类制品中N-亚硝胺化合物的转化机制

目前认为，N-亚硝胺主要是由亚硝化试剂中的亚硝酰离子与胺类物质发生取代反应所形成[16]。

肉制品中的亚硝酰离子大部分来自于亚硝酸盐。亚硝酸盐因其具有良好的防腐、护色等作用常被作为一种食品添加剂运用于肉类加工中，且已被证明其含量与N-亚硝胺含量呈正相关[15, 20-21]。亚硝酸盐在酸性条件下转化为亚硝酸。因亚硝酸的不稳定性，易分解成为亚硝酐(N2O3)。亚硝酐是一种活性的亚硝化反应产生的化合物质，可与胺类物质亚硝基化反应最终形成亚硝胺[22]。除此之外，在肉制品的熏制加工过程，容易产生气态氮氧化物。该物质是亚硝酰离子的重要来源。肉制品中发生亚硝化反应的胺类往往是二级胺，其一部分来自蛋白质的过度氧化，另一部分则来自肉中本身所含的生物胺发生的环化反应和脱氨基反应[23-24]。

N-亚硝化反应如下：

NaNO2+H+→HNO2+Na+

HNO2+H+→NO++H2O

2HNO2→N2O3+H2O

N2O3→NO+NO2

R2NH+NO+→R2NH-N=O+H+

2 N-亚硝胺的生物控制技术的研究进展

由于超量的N-亚硝胺对人体存在强致癌性及遗传毒性的危害。在食品安全方面，如何控制食品中N-亚硝胺含量，是近年来食品安全领域重点的研究方向之一。目前常用的控制方法根据其应用技术的原理不同可分为三类：物理方法、化学方法及生物方法。物理方法常用热降解、辐照降解及改进包装方式来进行控制。RYWOTYCKI[25]发现巴氏杀菌可减少罐头中N-亚硝胺的含量。王凯丽[12]发现超高压处理的香肠在贮藏过程中N-亚硝胺含量也会降低。辐照处理可以破坏亚硝酸盐的分子结构，产生大量自由基，使得N-亚硝胺的含量有一定的降低；辐照还可以直接分解N-亚硝胺[26]。二氧化碳充气包装通常比真空包装抑制N-亚硝胺生成效果好，真空包装的效果则好于不包装，这可能是由于氧气浓度导致的。化学方法则常采用添加抗氧化剂和亚硝酸盐替代的方法降低N-亚硝胺含量。多酚[27]、抗坏血酸[28]、中草药[29]等中的抗氧化成分能够将肉制品中残留的亚硝酸盐等还原，同时可以清除部分NO+。在亚硝酸盐替代上常用红曲色素[30]、番茄红素[20, 31]、乳酸链球素等。

目前的研究表明，生物控制一方面降解或抑制N-亚硝胺前体物质的生成，另一方面则转化已生成的N-亚硝胺或直接降解N-亚硝胺。

乳酸菌很早便被运用于肉制品的加工过程中，它能够改善产品质构，促进发酵肉制品的特殊风味形成、改善其色泽、有效提升了肉类制品中的食用可靠性[32-35]。近年来研究发现乳酸菌可以通过降低亚硝酸盐含量[14, 36-41]、降低生物胺含量[42-44]、阻断N-亚硝胺的形成[19,45-46]以及直接降解N-亚硝胺[37,43,47-50]等4种途径，有效降低肉制品中N-亚硝胺含量。

2.1 乳酸菌种类对于食品中亚硝酸盐的控制技术

亚硝酸盐因其优良的发色作用及防腐作用而常常被作为食品添加剂加入到肉制品生产过程中，HERRMANN等[14]发现添加到香肠中的亚硝酸盐与N-亚硝胺的残余量成正相关,故而在食品加工的安全把控环节，我们可以通过有效减少食品中的亚硝酸盐含有量，从而减低N-亚硝胺。

张兴吉等[36]的研究表明副干酪乳杆菌、短乳杆菌具有高效、稳定的降解亚硝酸盐的能力。XIAO等[37]在MRS肉汤中评估戊糖片球菌的亚硝酸盐消耗能力，发现其能直接降解亚硝酸盐。SUN等[38]在哈尔滨干香肠中接种戊糖乳杆菌、弯曲乳杆菌、清酒乳杆菌，发现相较于对照组而言，发酵9 d后3组中亚硝酸盐含量均降低了，且降低效果为弯曲乳杆菌>戊糖乳杆菌>清酒乳杆菌，N-亚硝胺含量与此结果一致。其中弯曲乳杆菌减低的效果最显著。而戊糖乳杆菌仅对N-二丙基亚硝胺、N-亚硝基二苯胺有显著降低，清酒乳杆菌降低效果较差。这说明一些乳酸菌具有降低亚硝酸盐的能力，且其降低能力因菌种的不同而有所差异。总结常见降低亚硝酸盐的乳酸菌主要由植物乳杆菌、短乳杆菌、乳球菌和乳球链球菌等[39]。探究乳酸菌降低亚硝酸盐的机理，重点可以细分成酶降解和酸降解2个阶段。在发酵前期即pH值>4.5时，主要是降解产亚硝酸盐的还原酶和抑制产硝酸盐还原酶的菌生长，随着发酵的进行，产生的乳酸使pH值降低，当pH值降低至4.0以下时变为酸降解为主[40]。

GE等[41]从金华火腿中分离出植物乳杆菌NJAU-01作为干腌发酵香肠的发酵剂，研究过程中发现，植物乳杆菌可以将肉中的棕色高铁肌红蛋白转化成为红色的亚硝基肌红蛋白，产生与亚硝酸盐相当的颜色。这表明部分乳酸菌能取代亚硝酸盐的发色功能，为其作为亚硝酸盐替代剂提供可能。

2.2 乳酸菌对食品中生物胺的控制技术

生物胺是肉制品中常见的一种胺类化合物，它与亚硝酐共同作用生成N-亚硝胺，是N-亚硝胺的前体物质，所以降低N-亚硝胺可以从降低生物胺入手。SUN等[42]发现植物乳杆菌及木糖链霉菌可以有效的抑制哈尔滨干香肠中尸胺、腐胺、色胺、2-苯乙胺、组胺和酪胺含量。许女等[43]的研究发现L.plantarumCP3含有能降解生物胺的sufⅠ基因，并且不会包含生物胺生成基因：hdc、tdc、odc等。该物质还能够有效减少食品中腐胺、尸胺、酪胺、组胺及亚精胺含量。充分抑制N-二甲基亚硝胺、N-二乙基亚硝胺及甲基乙基亚硝胺的生成。这说明降低生物胺能够抑制N-亚硝胺，而一些乳酸菌能够降低生物胺。当然，并不是所有的N-亚硝胺都与生物胺含量有关，例如N-亚硝基吗啡，它是由吗啡产生[24]，故不能用降低生物胺的乳酸菌进行降解。

2.3 乳酸菌控制N-亚硝胺的转化机制

N-亚硝胺是在酸性条件下形成，魏法山[19]研究表明pH值每降低1个单位，N-亚硝胺形成的速度就会加快10倍。但当pH值过低时，将抑制硝酸盐还原菌的活性，同时导致胺类物质质子化。尹立辉等[45]的研究显示在较低的反应区间内，随着pH值的升高，N-二甲基亚硝胺的含量增大，在pH值为3时最大，但当pH为5时，N-二甲基亚硝胺下降率为96.4%，故乳酸菌产酸能力及最适pH将影响N-亚硝胺的形成。XIAO等[37]发现接种了戊糖乳杆菌的香肠N-亚硝胺含量降低，他推测这可能是因为戊糖乳杆菌降低了pH值最终降低了亚硝胺。BERARDO等[46]认为在较低的pH条件下能够减缓蛋白质氧化，从而控制N-亚硝胺的生成。

2.4 乳酸菌对N-亚硝胺分解技术

NOWAK等[47]在乳酸菌胞内提取液中检测到了N-二甲基亚硝胺，推测乳酸菌降低亚硝胺的机理是降解或吸附。但这与肖亚庆[39]的结果不一致，肖亚庆在全细胞提取液中并未检测到N-亚硝胺的存在，认为只有降解作用，没有吸附作用。肖亚庆[39]推测这可能是因为N-亚硝胺首先被乳酸菌细胞吸附，随后再经代谢降解，NOWAK等[47]在测定时，N-二甲基亚硝胺标品浓度选择较高，为10 μg/mL，这时乳酸菌的降解速度低于吸附速率，所以测定时细胞内还存留有N-亚硝胺。故我们这里只讨论乳酸菌直接降解N-亚硝胺。

KIM等[48]将明串珠菌、肠膜明串珠菌属、乳酸杆菌和清酒乳杆菌接种在含有N-二甲基亚硝胺的MRS肉汤中，结果表明4种细菌皆可降解N-二甲基亚硝胺，且乳酸杆菌、清酒乳杆菌效果更显著。LIAO等[49]将植物乳杆菌120、酿酒酵母2018和木糖乳杆菌135接种至含有N-二甲基亚硝胺的培养液中，发现3株菌均可以降解N-二甲基亚硝胺，其中植物乳杆菌120降解率最高。许女等[43]发现L.plantarumCP3联合接种L.sakiM4含有协作效应，能显著地降解N-亚硝胺。肖亚庆[39]在研究L.pentosusR3时发现，当接种浓度为107CFU/mL和108CFU/mL 时N-亚硝胺含量有明显降低，而106CFU/mL则没有；发酵温度超过30 ℃时N-亚硝胺含量呈现显著性降低；发酵时间超过20 h时N-亚硝胺含量呈现显著性降低；在不同氧气含量的培养条件下降解N-亚硝胺含量能力没有显著变化，故乳酸菌直接降解N-亚硝胺的能力受到菌种、接种量、发酵温度、发酵时间的影响，与氧气含量没有显著关系。

肖亚庆[39]还通过比较L.pentosusR3的无细胞上清液与全细胞悬液、全细胞悬液与全细胞提取液、胞内提取液与细胞碎片悬液降解N-亚硝胺的能力，确定了降解N-亚硝胺的成分位于细胞碎片悬液中，可能位于细胞壁或细胞膜上，通过胰蛋白酶处理，确定降解亚硝胺的成分大多数为蛋白质。肖亚庆[37]对比了细胞碎片全蛋白和表层蛋白的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)测定结果如图1所示，二者近乎相似，故推测L.pentosusR3降解N-亚硝胺的蛋白质是表层蛋白，他推测表层蛋白可能为吸收、降解N-亚硝胺的酶提供位点，或其本身就是N-亚硝胺的降解酶。表层蛋白并非所有细菌都有，它是一种以非共价键附着在细胞壁外的蛋白质，在细胞蛋白含量中最高，通常采用嗜潮性试剂(如盐酸胍)和解离剂(如5 mol/L氯化锂)解离并溶解成蛋白质单体用于SDS-PAGE分析。通过质谱仪测定，L.pentosusR3中的表层蛋白，为假定蛋白，即目前没有发现其功能的蛋白。

A-细胞碎片前蛋白；B-表层蛋白Mareker-标准蛋白； Ls-清酒乳杆菌；Pp-戊糖片球菌；Lf-发酵乳杆菌；Sx-木糖葡萄球菌；Lp-戊糖乳杆菌图1 细胞碎片全蛋白和表层蛋白SDS-PAGE结果

李秀明等[50]同样证明了乳酸菌发酵剂PRO-MIX5能直接降解N-亚硝胺，且实验证实，菌体碎片是起抑制作用的关键。该技术广泛应用于红肠和培根。实验测定菌体碎片的加入量为0.05%时降解率最高，分别为41.04%和13.8%。但当提高菌体碎片含量时，抑制效果反而降低，N-亚硝胺含量甚至高于空白组。

这四方面并非单一作用，往往是同时起作用。肖亚庆[37]的研究证明L.pentosusR3降低N-亚硝胺的含量是因其表层蛋白的存在，直接降解了N-亚硝胺，同时L.pentosusR3还会通过降低pH、水分活度，从而抑制亚硝酸盐、生物胺等前体物质形成，减少食品中N-亚硝胺物质的含量。

3 总结与展望

N-亚硝胺作为一种肉制品加工过程中产生的常见有害物质，因其强烈的致癌、致畸、致突变等毒性，受到了人们的广泛关注。国内外大量的研究和调查发现，目前市面上仍存在部分产品中N-亚硝胺含量超标的现象，特别是在非工业化生产的肉制品和水产品中尤为严重。现有研究表明，长期食用此类产品可增加多种癌症的患病风险，故控制N-亚硝胺的含量对于食品质量和安全尤为重要。采用生物控制方式降低N-亚硝胺因其成本低、安全性高且能提高产品质量而倍受人们关注，进而也成为近年来食品安全控制领域研究的热点之一。在生物控制N-亚硝胺的研究中，利用乳酸菌接种发酵最为广泛。研究证明，乳酸菌可以通过降低亚硝酸盐含量、降低生物胺含量、转化N-亚硝胺以及直接分解N-亚硝胺4种途径，使食品中N-亚硝胺的含量下降。

目前，关于食品中N-亚硝胺的形成机制已较为清楚，但关于生物控制方法特别是乳酸菌对N-亚硝胺的降解机理及其降解产物研究仍不够充分，今后需要进一步采用现代分子生物学和组学等技术，研究降解N-亚硝胺的乳酸菌表层蛋白物质结构、功能特性及其具体降解过程。此外，还可以利用微生物代谢组学技术分析乳酸菌降解N-亚硝胺的降解中间产物并对其毒理学特性进行研究。综上所述，对乳酸菌降解N-亚硝胺进行深入研究，有助于进一步阐明N-亚硝胺在乳酸发酵过程中实现生物降解的细胞学和生物学机制，这不仅为N-亚硝胺的生物控制提供理论依据，而且对于实际生产中有效控制发酵食品中N-亚硝胺的含量，保障发酵肉制品和水产品的食用安全性都具有非常重要的意义。