羊源性D型产气荚膜梭菌的分离及PCR鉴定

阚 威，张总超，马艳萍，王谢忠，王文勇，王云平

(1.青海省动物疫病预防控制中心，青海 西宁 810000 ； 2.青海省互助县动物疫病预防控制中心，青海 互助 810700)

产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens，C.perfringens)旧称魏氏梭菌(C.welchii)或产气荚膜杆菌(Bacillusperfingens)，因在机体内能产生气体，导致组织气肿，且能产生荚膜，故名产气荚膜梭菌[1]。该菌分布较广，可见于土壤、污水、饲料、食物、粪便以及人畜肠道等，是引起人类食物中毒、人畜气性坏疽及动物坏死性肠炎、肠毒血症的主要病原菌之一[2]。产气荚膜梭菌本身没有侵袭力，致病性完全取决于毒素的作用[3]。已发现的产气荚膜梭菌毒素至少有20种，α、β、ε和ι是主要致死毒素，根据产生这4种毒素的能力，可将该菌分为A(α)、B(α、β、ε)、C(α、β)、D(α、ε)和E(α、ι)5个毒素型[1]。D型产气荚膜梭菌可引起羔羊、绵羊、山羊、牛、马以及灰鼠的肠毒血症，山羊小肠结肠炎[4]。

本试验对青海省互助县送检的2份疑似产气荚膜梭菌病死羊组织，通过细菌学厌氧培养、生化特性并结合分子生物学方法鉴定为D型产气荚膜梭菌。此试验对产气荚膜梭菌病的诊断和检测具有实际意义，可供梭菌病的诊断参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 待检材料 互助县送检的2份病死羊组织病料(肝脏、肺脏)。

1.1.2 主要试剂和设备 试剂：核酸提取试剂盒，购自天隆生物科技有限公司；强化梭菌，购自杭州微生物试剂有限公司；血琼脂培养基；2 000 DNA Marker、PCR反应预混酶、50×TAE、琼脂糖，均购自北京全式金生物技术有限公司；D型和E型产气荚膜梭菌核酸，由中国农业科学院兰州兽医研究所周继章研究员惠赠。设备：细菌厌氧培养灌、显微镜、恒温培养箱、PCR扩增仪(Bio-RAD，Mexico)；凝胶成像系统(Analytik Jena，AG)、核酸自动提取仪、DYY-12型电脑三恒多用电泳仪和DYCP-31A型电泳槽，均购自北京六一仪器厂。

1.1.3 引物合成 参考已发表的文献[5-6]，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，产气荚膜梭菌16S rRNA基因和毒素基因(α、β、ε、ι)引物，引物序列及大小见表1。

表1 16S rRNA基因和毒素基因PCR扩增引物

1.2 方法

1.2.1 病原分离培养 将送检的2份病料组织(肝脏、肺脏)分别接种于强化梭菌液体培养基厌氧培养，取其24 h培养物划线接种于强化梭菌琼脂平板进行纯化培养；纯化菌落划线接种于血琼脂平板，45 ℃培养24 h后观察菌落形态；随机挑选血平板上单菌落接种于强化梭菌液体培养基，厌氧培养24 h，涂片革兰染色镜检。

1.2.2 分离株细菌牛乳爆裂发酵试验 将纯化培养的分离株细菌接种于牛乳，45 ℃厌氧培养12 h。待培养结束后观察试验结果。

1.2.3 产气荚膜梭菌毒素基因多重PCR扩增 取纯化后强化梭菌液体培养物，利用核酸自动提取仪，提取细菌基因组作为PCR反应模板。同时以参考菌株D型产气荚膜梭菌和E型产气荚膜梭菌作为对照。

毒素基因多重PCR扩增：α毒素基因条带大小为900 bp、β毒素基因条带大小为611 bp、ε毒素基因条带大小为396 bp、ι毒素基因条带大小为293 bp。PCR扩增体系为50 μL：PCR预混酶25 μL，α、β、ε、ι毒素基因上下游引物各1 μL，DNA模板5 μL，双蒸水12 μL。PCR扩增条件为：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.4 16S rRNA基因PCR扩增和基因同源性及系统发育分析 16S rRNA基因PCR扩增：16S rRNA基因条带大小为4 811 bp，PCR扩增体系为50 μL：PCR预混酶25 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，双蒸水21 μL。PCR扩增条件为：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

16S rRNA基因的PCR扩增产物送至北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序，测序结果在NCBI数据库中进行Blast比对分析，并应用MEGA 5.1软件对16S rRNA基因序列进行同源性分析及系统进化树的构建。

2 结果与分析

2.1 病原分离培养及菌落形态特征 从2份病料组织中分离得到1株使血平板呈β溶血的菌株。其菌落形态特征为表面光滑、隆起、半透明、边缘整齐，菌落直径2～5 mm，革兰染色为阳性大杆菌。见中插彩版图1和图2。

2.2 分离株细菌牛乳爆裂发酵试验 分离株细菌接种牛乳45 ℃培养12 h后，牛乳呈“爆裂发酵”，结果见中插彩版图3。

2.3 产气荚膜梭菌毒素基因多重PCR扩增 分离株细菌和参考菌株D型产气荚膜梭菌、E型产气荚膜梭菌经α、β、ε、ι毒素基因多重PCR扩增，分离株细菌扩增可得α毒素基因(900 bp)和ε毒素基因(396 bp)的目的基因条带，扩增结果如图4所示。

图4 分离株细菌毒素基因多重PCR扩增结果Fig.4 Multiple PCR amplification of bacterial toxin geneM：DNA 2 000 Marker； 1：分离株细菌； 2：参考菌株D型产气荚膜梭菌； 3：参考菌株E型产气荚膜梭菌M:DNA 2 000 Marker; 1:Isolated bacterias; 2:Clostridium perfringens type D; 3:Clostridium perfringens type E

2.4 16S rRNA基因PCR扩增和同源性及系统发育分析 分离株细菌经产气荚膜梭菌16S rRNA基因PCR扩增，可得481 bp的目的基因条带，扩增结果如图5所示。对分离菌株细菌16S rRNA基因进行测序，测序结果显示：分离株细菌的16S rRNA基因序列在线Blast分析显示，其16S rRNA基因序列与GenBank上已登录的(登录号:NR113204.1、NR121697.2)产气荚膜梭菌相应序列具有高度同源性(≥99.0%)。根据16S rRNA基因序列与上述同源性较高的D型产气荚膜梭菌GenBank (登录号:NR113204.1、NR121697.2)的相应序列和相关D型产气荚膜梭菌(登录号:LC386311.1、KU714939.1，来源见表2)建立系统进化树，如图6所示，分离株细菌与参考菌株分属2个大的分支，其中分离株与其同源性较高的NR113204.1、NR121697.2处于一个小的分支，且分离株细菌同伊朗疫苗毒株(KU714939.1)的遗传关系较为亲密。

图5 分离株细菌16S rRNA PCR扩增结果Fig.5 PCR amplification results of 16S rRNA of isolated bacteriasM：DNA 2 000 Marker； 1：分离株细菌M:DNA 2 000 Marker; 1:Isolated bacterias

表2 4株D型产气荚膜梭菌参考菌株的名称及来源Table 2 The name and source of a reference strain of Clostridium perfringens

3 讨论

产气荚膜梭菌是一种重要的人兽共患的病原体，其释放的毒素可引起多种动物的肠毒血症和坏死性肠炎，也是一种在人医临床上比较常见的食物中毒致病菌。羊肠毒血症(Enterotoxemia)就是由D型产气荚膜梭菌感染引起的，又因剖检该病死动物时，发现肾脏组织软化现象，故称该病为“软肾病”，根据其临床症状此类病又称之为“类快疫”[7]。该病多呈散发，可感染绵羊、山羊，2～12月龄易发病。其病程短，多数为突发，病畜多数为无症状突然死亡，有的可见四肢抽搐等症状；有的则没有表现出神经症状，而是呈现虚脱、昏迷或悄然死亡[8]。D型产气荚膜梭菌主要依附在土壤、污水、羊肠道以及粪便中，春夏交替之季或者秋季是羊肠毒血症的高发期，因为在此期间羊主要以谷类与草料为主食，此类主食中含有丰富的蛋白质，通过胰蛋白酶转化成了ε原毒素，继而引发羊肠毒血症[9]。此次送检的2份病死羊组织，怀疑为羊梭菌性疫病，根据送检单信息，该养殖户存栏藏系绵羊600多只，死亡14只，10月6日对羊只进行了羊小反刍兽疫和羊四联苗免疫。但是该养殖场在羊只发病死亡期间曾饲喂大量麻渣，因此怀疑此次疫情的发生与饲喂高蛋白的麻渣有必然联系。

图6 基于16S rRNA基因序列的遗传进化树Fig.6 Genetic evolution tree based on 16S rRNA gene sequence

近年来青海省牛、羊梭菌病呈散发形势流行，对于梭菌病的防控只能采用疫苗免疫进行预防，但是鉴于产气荚膜梭菌分型较多，每型的致病性各异，传统细菌学诊断方法耗时耗力，应用一种快速的产气荚膜梭菌诊断方法，可以大大节省时间和财力。本试验通过查阅国内外相关文献，主要以分子生物学手段为基础，参照已发表文献的产气荚膜梭菌16S rRNA和毒素基因引物，利用多重PCR分型方法，对临床分离的产气荚膜梭菌进行了分型鉴定。为今后产气荚膜梭菌病的诊断、流行病学调查、制定防制措施提供科学依据，也为疫苗的研究和使用提供技术支持和储备。