广东省屠宰场猪群PRRSV感染状况调查及基因测序分析

许秀琼，查云峰，王福广，刘 劼，吴立炀，叶 建，孙彦伟

（1.广西大学，广西南宁 530000；2.广东省动物疫病预防控制中心，广东广州 510230）

猪繁殖与呼吸障碍综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）俗称蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的一种高度接触性传染病，主要表现为妊娠母猪流产，产死胎和木乃伊胎，以及各年龄段猪群出现持续性高热和呼吸道症状[1]。PRRSV 分为美洲型和欧洲型两种基因型，其中美洲型代表毒株为VR2332 毒株，欧洲型为Lelystad virus（LV）毒株[2]，两者基因差异较大，核苷酸同源性为50%～60%[3]。最近关于我国欧洲型 PRRSV 的报道逐渐增多，而其遗传多样性依然未知。PRRSVORF5基因编码的病毒糖基化囊膜蛋白GP5，是PRRSV 中变异程度最大的结构蛋白之一，具有较好的免疫原性，可以诱导机体产生中和抗体[4-5]，因此ORF5基因序列可在一定程度上反映出PRRSV 的遗传变异情况[8]。本研究对2019年广东省部分地区43 个屠宰场采集到的840 份猪淋巴结样品进行实时荧光RT-PCR 检测，了解屠宰场猪群的PRRSV 隐性带毒情况。此外，选取部分PRRSV 阳性样品进行ORF5基因扩增测序，以及核苷酸同源性分析和遗传进化分析，了解该地区的PRRSV 遗传变异情况，以期为有效防控PRRS 提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 样品收集

样品来源于2019年广东省21 个市的43 个生猪屠宰场；每个屠宰场随机抽取10～20 头临床健康猪，无菌采集淋巴组织，-20 ℃保存，共采集淋巴结样品840 份。

1.2 试剂

DEPC water、50×TAE、PermixTaq（ExTaqVersion 2.0 plus dye）、Oligo dT Primers、Reverse Transcriptase（M-MLV）、Random Primers、Recombinant RNase Inhibitor、dNTP Mixture、DL 2000 DNA Marker，购自大连宝生生物公司；氨苄磁珠法核酸提取试剂盒，购自Thermo 公司；PRRSV通用型实时荧光RT-PCR 检测试剂盒和PRRSV 欧洲株实时荧光RT-PCR 检测试剂盒，购自哈尔滨元亨生物药业有限公司。

1.3 仪器

荧光PCR 仪（罗氏，Light Cycler 480 Ⅱ）；全自动磁珠提取纯化系统（Thermo，KingFisher Flex）；高速冷冻离心机（eppendorf，5424R）；超净工作台（济南鑫贝西生物技术有限公司，BBS-V 1300）；生物安全柜（Thermo，Forna 149）；组织匀浆仪（罗氏，MagNA Lyser）；小型高速离心机（湘仪，H1650-W）；旋涡震荡仪（IKA，MS3）；凝胶成像系统（Protein Simple，Alphalmager HP）；电泳仪（北京六一，DYY-6C）。

1.4 引物设计与合成

根据 GenBank 中收录的分离自我国的PRRSV全基因组序列，选择保守区域，利用Oligo7.0 设计3 对检测引物（表1）。引物序列由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。

表1 本研究设计和采用的引物

1.5 核酸提取

按照氨苄磁珠法核酸提取试剂盒和KingFisher Flex 全自动磁珠提取纯化系统的使用方法进行RNA 抽提，抽提产物用于后续RT-PCR 检测。

1.6 RT-PCR 检测

严格按照PRRSV 通用型实时荧光RT-PCR 检测试剂盒和PRRSV 欧洲株实时荧光RT-PCR 检测试剂盒使用说明书进行操作。

将各地区实时荧光RT-PCR 检测阳性的核酸样品进行普通RT-PCR 检测，通过凝胶成像系统观察结果，将观察到的目的条带进行切胶回收，纯化样品，送测序，并对结果进行统计分析。

2 结果

2.1 实时荧光RT-PCR 检测

荧光RT-PCR 检测结果显示，广东省不同区域屠宰场均有不同程度的美洲型PRRSV 和欧洲型PRRSV 核酸阳性被检出。在采集的840 份淋巴组织中，PRRSV 阳性检出率为17.02%，其中美洲型为14.29%，欧洲型为2.73%；粤东、粤北、粤西和珠三角地区美洲型阳性检出率分别为7.50%、13.13%、6.88%、21.11%，欧洲型分别为1.25%、0.63%、0.63%、5.28%。

2.2 ORF5 基因遗传进化分析

将荧光RT-PCR 检测阳性的核酸样品进行普通RT-PCR 扩增反应，成功扩增到15 个阳性样品。将这15 个目的条带纯化、测序，截取ORF5序列信息进行分析。在GeneBank 上选取PRRSV 参考毒株与2019年测得的ORF5序列进行遗传进化分析，结果如图1 所示。采用NJ 法MEGA6，自举检验值为1 000。从遗传进化树上可以看出，有3株毒株为欧洲型，12 株毒株为美洲型。而美洲型毒株中，有5 株处于以JXA1 为代表毒株的分支上，2 株处于以VR2332 为代表毒株的分支上，2 株处于以NADC30 为代表毒株的分支上，3 株处于以GM2 为代表毒株的分支上，没有检测到以CH1-a和NT1 为代表毒株分支的毒株。

图1 PRRSV ORF5 基因遗传进化分析结果

2.3 ORF5 基因核苷酸同源性分析

从 图2 可以看出，检测到的3 株 欧洲型毒株ORF5基因间的核苷酸相似度为90.2%～92.4%，与LV 株ORF5基因的核苷酸相似度为86.9%～88.2%。检测到的12 株美洲型毒株ORF5基因间的核苷酸相似度为87.5%～99.6%，各分支毒株与其所属分支的代表毒株JXA1、VR2332、NADC30、GM2 的ORF5基因间的核苷酸相似度分别为98.4%～99.4%、99.1%～99.3%、95.7%～96.6%、92.6%～94.7%。

2.4 GP5 蛋白氨基酸变异分析

图2 PRRSV ORF5 基因核苷酸同源性分析结果

图3 PRRSV GP5 氨基酸位点变异分析结果

以VR2332 为标准毒株，对检测到的12 株美洲型PRRSV 的GP5 蛋白信号肽、诱导表位、第一高变区、中和表位、第二高变区、跨膜区及细胞表位进行氨基酸位点变异分析。由图3 可以看出，大部分检测毒株信号肽区发生第3位（由E突变为G）、第11 位（由Y 突变为C）、第16 位（由S 突变为F）等氨基酸位点变异；诱导表位中，有3 株毒株发生1 个氨基酸位点变异，1 株发生2 个氨基酸位点变异；高变区中，氨基酸变异位点较多，但也有1 株毒株没有发生变异；中和表位中，第38 位氨基酸有3 株毒株由H 突变为Y，第39 位有5 株毒株由L 突变为I、2 株突变为S、1 株突变为T；跨膜区主要发生第66 位（由S 突变为T/C）、第101 位（由F 突变为Y）、第102 位（由V 突变为Y/H/R）等氨基酸位点变异；细胞表位的变异主要有第121、127、161、185、189、200 位等氨基酸位点的变异。第13 位和151 位氨基酸是与毒力相关的位点，其中：第13 位点中，有3 株为Q，9 株由Q 突变为R；第151 位点中，有8 株为R，4 株由R 突变为K。

3 讨论

PRRSV 1987年首次在美国被发现[6]，随后在世界主要养猪国家和地区广泛传播。1996年我国首次检测到PRRSV，证明了PRRSV 在猪群中的存在。2006年出现的高致病性PRRSV 毒株使我国养猪业遭到重创[7]。2013年出现新的PRRSV 变异株NADC30-Like 毒株[8]，使得我国的PRRSV 流行更加多样化，防控更加复杂化。尽管目前国内采取了PRRSV 疫苗免疫等防控措施，使得PRRSV流行强度呈现减弱趋势，但PRRSV 仍然影响着养猪业。PRRSV 可引起持续性感染，病毒血症期可持续6～7 周，甚至长达16 个月。PRRSV 活疫苗（JXA1-R 株）免疫后在体内持续时间较长，60 d后基本为阴性[8]。疫苗毒株与临床PRRSV 毒株在传播方式、存留时间等方面均具有相似特点，如在皮肤破损的情况下，易经胃肠道外途径感染，从而将疫苗病毒传播给非免疫猪，持续散播疫苗病毒，使其在猪群中循环存在。育肥猪是PRRSV 的主要携带者之一，是PRRSV 的重要传染源。因此，亟需落实与强化规模化猪场生物安全措施，继续推动PRRSV 的净化工作。

目前，我国PRRSV 呈现多种亚型共存的局面，近年来，除检测到美洲型PRRSV 以外，也检测到了欧洲型PRRSV。1997年北京市首次发现并鉴定我国最早的欧洲型PRRSV B13 株[9]，接着2006年和2013—2014年福建省发现[10]，2007年浙江省发现[11]，2010年香港发现[12]，2011年贵州省发现[13]，2012 辽宁省发现[14]；2016—2018年黑龙江省、河南省先后发现[15]，说明欧洲型PRRSV 呈现扩散流行趋势。本研究通过检测发现，来自屠宰场的临床健康屠宰生猪中，仍然存在一定比例的隐性感染或带毒情况，其中美洲型PRRSV 阳性率为14.29%，欧洲型为2.73%。虽然欧洲型毒株的检出率不高，但建议引起重视。尽管已报道的国内欧洲型PRRSV 致病力较低，尚未对我国的养猪业带来较大影响，但感染后会增加继发感染其他病原的概率。此外，欧洲型PRRSV 在我国暂无疫苗保护，而我国欧洲型PRRSV 的检出率逐年增高，因此加大对欧洲型PRRSV 的流行病学监测，对于控制其流行具有重要意义。

对检测到的15 株PRRSVORF5基因进行遗传进化分析发现，其在以JXA1、VR2332、NADC30、GM2、LV 株为代表毒株的分支上均有分布，说明在广东省屠宰猪群中携带的PRRSV 类型比较复杂，其中有5 株毒株属于JXA1 分支毒株，占比达到33.33%，说明流行毒株以高致病性毒株为主。检测到的3 株欧洲毒株与LV 毒株ORF5基因间的核苷酸同源性为86.9%～88.2%，遗传变异较大，应谨防遗传变异引起PRRSV 毒力增强带来的危害。通过GP5 蛋白氨基酸变异分析发现，蛋白信号肽、中和表位和3 个细胞表位区域存在较多的氨基酸变异。其中：中和表位中，有5 株毒株发生L39I突变，2株发生L39S突变，1株发生L39T突变。这些突变有可能会对GP5 蛋白的免疫原性造成一定影响，从而影响疫苗的免疫效果，导致免疫失败。另外，与毒力有关的第13 位和第151 位氨基酸位点中，有9 株毒株发生Q13R 突变，有4 株发生R151K 突变。这有可能会引起毒力增强，出现新的高致病性毒株。

本次试验样品采自广东省21 个市的屠宰场，大部分生猪来源于广东本地，部分生猪由外省调入。总的来说，广东省屠宰猪群中PRRSV 携带率较高，血清型复杂，欧洲型和美洲型都有，部分毒株遗传变异大。这从侧面反映出PRRSV 在各地养殖场中的流行依然较严重。建议猪场严格生物安全措施，加强监测，继续推动种猪场PRRSV 的净化工作。