HPV E6/E7 mRNA和DNA分型检测在宫颈病变筛查中的临床价值

林晓红,陈 柳,高亚娟,燕 凤,李 佳,杨 红

(中国人民解放军空军军医大学第一附属医院妇产科,西安 710032;*通讯作者,E-mail:yanghongfck@163.com)

宫颈癌是发病率非常高的妇科恶性肿瘤之一,严重威胁着女性的生命健康,我国近10年来发病率呈上升趋势并且呈年轻化趋势[1-3],如何有效地防控宫颈癌的发生和发展显得尤为重要。大量研究已经证实宫颈癌发病的主要原因是人乳头瘤病毒(HPV)的长期持续感染[4,5]。HPV为小DNA病毒,呈球形,无包膜,20面立体对称结构。基因组是双链环状、以共价闭合的超螺旋、开放的环状DNA结构。侵染人的上皮黏膜细胞,通常引起生殖器疣、子宫颈和肛门癌。HPV的基因组包含3个基因区:不编码蛋白的长调控区(LCR),早期基因区(E1,E2,E4,E5,E6,E7)和晚期基因区(L1,L2)。早期基因的产物用于病毒的复制扩增,晚期基因的产物用于包装病毒。其中,E6、E7为宫颈癌的致癌基因。宫颈癌作为目前唯一明确病因的妇科肿瘤,可以通过有效的筛查做到早发现早治疗,从而有效防控宫颈癌前病变的发生与发展。目前宫颈癌筛查主要以细胞学和HPV基因检测联合筛查为主,对于疑似宫颈病变的患者转阴道镜活检。临床上对于子宫颈上皮内瘤变的管理是按照规范操作,平衡利与弊,避免诊断与治疗的不足与过度。因为CIN1多为HPV一过性感染所致,自然消退率很高,因此对于低级别鳞状上皮内瘤变(LSIL,即CIN1)的患者,原则上是无需治疗,随诊观察。而对高级别鳞状上皮内瘤变(HSIL,即CIN2和CIN3)和原位癌患者,则应及时予以治疗,阻断发展为子宫颈浸润癌的可能性,从而减少子宫颈浸润癌的发生。本研究通过比较分析HPV E6/E7 mRNA检测和HPV DNA分型检测在临床宫颈病变患者中的检测结果,探讨两种HPV基因检测方法在宫颈癌筛查中的应用效果及对宫颈病变的诊断价值。

1 材料与方法

1.1 病例资料

回顾性分析2016年3月至2018年3月在本院妇科门诊就诊的患者(包括健康体检者和有临床症状表现为宫颈炎症、阴道不规则出血等的患者,排除既往患有宫颈癌前病变、近期有激素使用史的患者),均行HPV E6/E7 mRNA检测和HPV DNA分型检测的患者的临床资料,其中发现疑似宫颈病变转阴道镜活检的患者916例,年龄为20-76岁,平均年龄(42.7±11.9)岁。以活检结果为金标准,对HPV E6/E7 mRNA检测和HPV DNA分型检测结果进行比较分析。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 避开月经期,取样前3 d内无阴道上药和冲洗,24 h内无性生活,采用专用的采样刷,于宫颈鳞状上皮和柱状上皮交界处,沿顺时针方向旋转5-7圈后置于专用的标本保存液中。

1.2.2 HPV E6/E7 mRNA检测 使用Quanti VirusTMHPV E6/E7 mRNA检测试剂盒(试剂盒和检测仪器来源于河南科蒂亚生物技术有限公司)可检测WHO公布的14种高危亚型HPV E6/E7 mRNA(HPV 16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66,68),不分型。采用支链DNA信号放大技术,标本经过裂解、杂交捕获、信号放大、酶促化学发光,通过冷光仪检测,超过发光阈值为阳性。

1.2.3 HPV DNA分型检测 使用HPV27全分型检测试剂盒(源于上海透景生命科技股份有限公司)可检测13种高危亚型HPV(HPV 16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66)和4种可能高危亚型HPV(HPV 68,26,53,82)及10种低危亚型(HPV 6,11,40,42,43,44,55,61,81,83)。采用流式荧光技术,标本经过核酸提取,PCR扩增、杂交,通过Luminex-200仪检测信号,结果大于150的型别为阳性。

1.2.4 阴道镜检查及宫颈活检 宫颈充分暴露后,使用4%醋酸溶液涂抹整个宫颈,全面观察后用碘液涂抹,充分观察对白色病变、点状血管、碘不着色等可疑病变部位行多点取样及宫颈搔刮术。采集的活检组织使用甲醛固定处理,送至病理科进行活检:标本经脱水、组织包埋、切片、染色、封片后,由2位专业的病理诊断医生进行阅片诊断,诊断结果描述采用世界卫生组织三级分类法,分为宫颈炎症、轻度宫颈上皮内瘤变(CIN1)、中度宫颈上皮内瘤变(CIN2)、重度宫颈上皮内瘤变(CIN3)和宫颈癌。

1.2.5 统计学处理 采用SPSS 22.0软件进行数据分析,采用灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比、阴性似然比及ROC曲线下面积指标评价两种检测方法诊断价值,不同宫颈病变分组中HPV E6/E7 mRNA拷贝数采用中位数(四分位数)表示,组间比较采用非参数检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 916例行阴道镜活检患者检测结果概况

916例患者的活检结果:宫颈炎239例,CIN1 342例,CIN2 91例,CIN3 183例,宫颈癌61例。CIN1-3患者共616例,年龄分布:20-29岁79例(12.8%),30-39岁230例(37.4%),40-49岁211例(34.3%),50-59岁71例(11.5%),60-69岁23例(3.7%),年龄≥70岁2例(0.3%)。61例宫颈癌患者年龄分布为:20-29岁2例(3.3%),30-39岁13例(21.3%),40-49岁23例(37.7%),50-59岁14例(23.0%),60-69岁9例(14.7%)。在高级别宫颈病变(CIN2以上)及宫颈癌的335例患者中,单一高危亚型感染率高的型别有HPV16、58、33、31、56、18、52,占比75.6%;双重感染的患者共39例,占比11.6%。在61例宫颈癌患者中感染HPV16高危亚型的33例,占比54.0%,感染HPV18亚型的6例,占比9.8%。

2.2 HPV E6/E7 mRNA和HPV DNA分型检测结果分析

在炎症组中,HPV E6/E7 mRNA检测的阳性率低于HPV DNA分型检测,差异有统计学意义(P<0.05)。在CIN1和CIN2组中,两种检测方法的阳性率差异无统计学意义。CIN3组和宫颈癌组的HPV E6/E7 mRNA检测的阳性率高于HPV DNA分型检测,差异有统计学意义(P<0.05,见表1)。

表1 916例活检患者HPVE6/E7mRNA和HPV DNA分型检测结果分析 例(%)

2.3 HPV E6/E7 mRNA和HPV DNA分型检测对宫颈病变筛查的临床价值比较

为了进一步明确HPV E6/E7 mRNA和HPV DNA分型检测在宫颈病变筛查中的临床价值,本研究在活检结果的基础上比较了两种HPV基因检测方法的灵敏度、特异性、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比和阴性似然比(见表2)。结果表明,HPV E6/E7 mRNA检测的特异性、阳性预测值、阴性预测值,阳性似然比均高于HPV DNA分型检测,阴性似然比则低于HPV DNA分型检测。上述差异均有统计学意义。

表2 HPV E6/E7 mRNA和HPV DNA分型检测对宫颈病变诊断的临床价值比较

2.4 不同级别宫颈病变分组中HPV E6/E7 mRNA检测结果分析

本研究根据不同宫颈病变级别分组,统计了不同分组中阳性患者HPV E6/E7 mRNA的拷贝数。结果表明HPV E6/E7 mRNA拷贝数随着宫颈病变级别的加重而增加,差异有统计学意义(P<0.05,见表3)。

表3 不同宫颈病变级别的HPV E6/E7 mRNA拷贝数

3 讨论

HPV感染大多都是一过性感染,80%以上的妇女一生中都会感染HPV,但是大部分感染都可以在8-24个月内通过自身免疫系统清除,只有约9%-21%会发展为持续感染[6]。在感染早期,病毒基因在细胞内处于游离状态,一过性感染大多处于这个阶段。当HPV持续感染后,病毒基因整合到宿主细胞基因组中,HPV致癌基因E6、E7被激活,利用宿主细胞大量转录mRNA并翻译为E6、E7致癌蛋白。E6蛋白能够通过与E3泛素化连接酶E6AP结合形成复合体,进一步泛素化修饰p53,使得p53最终被蛋白酶降解而失去功能。由此导致细胞周期紊乱癌变,而随着细胞的不断增殖,病毒也得以大量扩增。还有研究表明E6蛋白可以激活细胞端粒酶。由于端粒酶本身具有抑制细胞程序性死亡的作用,因此激活端粒酶可以延长宿主细胞生存时间。E6蛋白不仅自身具有致癌作用,还可与其他致癌蛋白合作,高效地诱导细胞癌变。与E6生物学功能相关最密切的就是E7。有文献报道,E7可以使抑癌因子pRB失活,导致细胞癌变。此外,作为抗病毒机制,细胞间会通过干扰素进行通讯,而E6、E7蛋白不仅可以下调多种干扰素应答基因还可以直接降低两种干扰素的表达量,使得病毒逃逸人体免疫[7],另外,E6、E7蛋白可以激活上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT),增强恶性细胞的侵袭力[8-10]。因此,近年来,大量国内外研究认为E6/E7 mRNA的持续大量表达是宫颈癌变的必要条件。有研究表明在宫颈癌筛查中HPV E6/E7 mRNA较HPV DNA有相近的灵敏度和更高的特异度[11]。

HPV DNA检测是以HPV的L1基因为靶标,无法排除一过性感染,易引起过度诊疗,增加患者生理上的痛苦和心理上的负担。而HPVE6/E7 mRNA检测是以HPV的致癌基因E6、E7转录的mRNA为靶标,可以反映致癌基因的活跃程度,理论上能更好反映癌变转化风险,同时可以有效减少HPV一过性感染的检出,减少不必要的阴道镜转诊。有研究报道活检结果为CIN1患者有47%-62%可以转为正常,22%-37%维持原状,15%-16%会进一步进展;CIN2患者有43%-54%可以转为正常,16%-35%维持原状,30%会进一步进展;CIN3患者只有20%-30%可以转为正常,70%-80%会进一步进展。因此如何准确地筛查分流出宫颈病变高风险的患者,及时治疗阻断宫颈癌发生发展显得尤为重要。

本研究结果显示,在活检结果为宫颈炎症的患者中HPV E6/E7 mRNA的阳性率远低于HPV DNA检测的阳性率,差异有统计学意义。这与Baron等[12]的结果一致。这可能是由于大多数HPV感染是一过性感染,病毒基因并未整合到宿主基因中或者整合程度低,HPV E6/E7 mRNA检测呈阴性,表示样本宫颈细胞无恶变转化风险或者处于静止期,但HPV DNA检测仍可以检测到HPV病毒的存在。在CIN3以上的宫颈高级别上皮内病变中,HPV E6/E7 mRNA检测的阳性率高于HPV DNA检测,差异有统计学意义。其中有7例宫颈癌患者的HPV E6/E7 mRNA呈阳性而HPV DNA检测呈阴性,可能是在病毒基因整合到宿主基因时,发生了L1丢失,因此HPV DNA检测呈阴性;另一方面,血性标本也会影响HPV DNA分型检测的结果。本研究结果还显示,在高级别上皮内病变(CIN2及以上)患者中HPV E6/E7 mRNA的灵敏度、特异性,阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比以及ROC曲线下面积AUC均比HPV DNA分型检测高,表明HPV E6/E7 mRNA检测对宫颈病变诊断的临床价值更高。

宫颈病变的发生和发展与感染HPV的型别、病毒载量和致癌基因的活跃程度密切相关[13]。在14种高危亚型HPV中,HPV16和HPV18与宫颈癌的发生关系最密切。本研究结果显示,61例活检结果为宫颈癌的患者,感染HPV16高危亚型的33例,占比54.0%,感染HPV18亚型的6例,占比9.8%,双重感染5例,占比8.2%,双重感染者均感染HPV16或HPV18,由HPV16和HPV18引起的宫颈癌占72%,这与Lees等[14]的研究结果一致。因此对于HPV16和18阳性的患者应引起足够重视,另外HPV58、33、31、52、56阳性也应引起重视。HPV E6/E7 mRNA检测结果拷贝数在不同程度宫颈病变分组之间存在显著差异,HPV E6/E7 mRNA拷贝数随着宫颈病变程度增加而升高,这与国内外研究报道一致,HPV E6/E7 mRNA的拷贝数与宫颈病变的严重程度相关[15-17]。HPV E6/E7mRNA拷贝数反映着HPV致癌基因表达的活跃程度,拷贝数越高表示样本宫颈细胞恶变转化风险越高。对于细胞学筛查结果为ASCUS以及病理结果为CIN1-2的患者,可以根据E6/E7 mRNA拷贝数进行分流。HPV E6/E7 mRNA检测对于筛查出宫颈病变高风险的患者,并及时采取治疗,阻断宫颈癌发生发展具有重要的参考意义。

宫颈癌筛查最理想的结果是筛查益处最大化,潜在风险最小化:需要识别可能发展为浸润癌的宫颈癌前病变和原位癌并及时给予阻断治疗,还要避免对一过性HPV感染及其导致的良性病变的探查和不必要的治疗,甚至过度治疗。本研究表明,HPV E6/E7 mRNA检测与高级别宫颈病变的相关性更强,对宫颈病变的发生发展有很好的预测意义,对宫颈病变的诊断价值高于HPV DNA分型检测,是临床诊疗中更高效可靠的筛查方法。