肉芽肿性乳腺炎不同中医证型中免疫相关因子表达变化及临床意义

刘晓菲，王楠，李斐斐，宋爱莉，张丽美

(1.山东中医药大学第一临床医学院，山东 济南 250335；2.山东省中医药研究院，山东 济南 250014)

肉芽肿性乳腺炎又称肉芽肿性小叶性乳腺炎(granulomatous little mastiffs，GLM),是指乳腺的非干酪样坏死，局限于小叶的肉芽肿性病变。多数专家认为GLM是一种由多种炎症细胞和细胞因子参与的免疫相关疾病[1]。中医因其发病初期以肿块为主，中期热盛肉腐成脓，后期破溃流脓形成瘘管或窦道的临床特点，将其归属于乳痈、乳漏范畴[2]。本研究结合临床及相关文献[1-5]将本病分为肝郁痰凝证(肿块期)、热毒炽盛证(脓肿期)及正虚毒恋证(溃后期)三期，分析山东中医药大学附属医院手术治疗GLM患者的临床资料，研究其病理学特征及不同证型中相关指标的表达和差异；为治疗GLM在免疫学方面提供可参考的临床依据，以及不同的诊疗思路。

1 资料与材料

1.1 资料

研究对象均来自于2017年1月—2018年12月于山东中医药大学附属医院乳腺外科接受手术治疗且病理诊断为肉芽肿性乳腺炎的女性患者。排除标准:①未经过系统治疗即出院的病例；②病理诊断不明确的患者；③病例资料不完整影响统计分析的病例；④合并其他免疫相关疾病的病例；⑤合并其他乳房疾病如乳房结核，影响结果分析的患者。剔除标准:①治疗期间有严重不良反应者；②病理组织较小，不足以做免疫组化的病例。

本研究最终纳入符合标准的50例患者，按照中医证型标准分组：肝郁痰凝证(肿块期)、热毒炽盛证(脓肿期)、正虚毒恋证(溃后期)。其具体资料如下：肿块期15例患者，15例已育、0例未育，年龄分布为24～39岁，平均年龄为(31.55±1.03)岁；脓肿期18例患者，17例已育、1例未育，年龄在26～42岁，平均年龄为(33.27±2.21)岁；溃后期17例，17例已育、0例未育，年龄分布为28～40岁，平均年龄为(33.80±1.81)岁。三组患者年龄、已婚已育比例比较均无统计学意义(P>0.05)，研究有可比性。

1.2 中医证型分期

考虑本病和乳痈的临床表现相似，参考陈红风主编的《中医外科学》乳痈分期、林毅《现代中医乳房病学》，并结合临床及相关文献[1-5]将本病进行分期如下。

(1)肝郁痰凝证(肿块期):乳房肿块,质韧硬,形态不规则,境界不清,表面不光滑,活动度较差,疼痛或有压痛,表面皮肤不红或微红,局部皮温正常或略高；无发热、恶寒等全身症状,少数腋下淋巴结可及肿大；舌淡白或淡红,苔薄白或白腻，脉沉弦。

(2)热毒炽盛证(脓肿期):肿块增大,红肿热痛加重,可累及多个象限,有波动感或穿刺有脓液抽出；可伴腋下淋巴结肿大、发热、恶寒等全身症状；舌质红,苔黄腻,脉滑数。

(3)正虚毒恋证(溃后期):乳房脓肿溃破,脓出不畅,或脓肿切开后失治误治,脓水淋漓,创面肉色不鲜；伴面色无华，神疲乏力，食欲不振，舌质淡,苔薄白,脉细无力。

1.3 仪器和设备

RM2235切片机(德国LEICA公司)，生物组织摊片烘烤机(湖北亚光医用电子技术有限公司)，捷达光学显微镜550D(沈阳优软科技发展有限公司)，EG1150H型生物组织包埋机(德国LEICA公司)。

1.4 试剂

兔抗人CD4多克隆抗体(万类生物科技有限公司，批号：wl0282)，兔抗人CD8多克隆抗体万类生物科技有限公司，批号：wl0281)，兔抗人TNF-α多克隆抗体万类生物科技有限公司，批号：wl0334)，兔抗人TNFα-r1(P55)多克隆抗体(万类生物科技有限公司，批号：wl0338)，SP免疫组化试剂盒(万类生物科技有限公司，批号：wl0776)，DBA显色试剂盒(万类生物科技有限公司，批号：wl0290)，PBS缓冲液(万类生物科技有限公司，批号:wla102)，二甲苯、苏木红、伊红(上海强顺化学试剂有限公司)。

2 方法

2.1 实验步骤

(1)收集病理蜡块，连续4 μm切片,每个蜡块组织切取5张切片,共计305张,分5组即HE染色组、CD4组、CD8组、TNF-α组、P55组。

(2)HE法染色：经二甲苯脱蜡切片，梯度乙醇脱苯，各梯度酒精分别约1～2 min，水洗，苏木精染细胞核，水洗，伊红染细胞质，各梯度乙醇脱水，中性树胶封片。

(3)免疫组化法：①将石蜡切片脱蜡至水;②抗原修复;③加入3%H2O2，室温10 min以灭活内源性过氧化物酶；④封闭；⑤孵育一抗：滴加适当一抗稀释液稀释一抗(分别按说明书浓度)，室温孵育1～2 h或者4 ℃过夜孵育。TBS冲洗3次，每次1 min。分别以说明书阳性组织做阳性对照，使用TBS缓冲液代替一抗作为阴性对照；⑥孵育二抗：滴加二抗，37 ℃孵育30 min，TBS冲洗3次，每次1 min；⑦DAB显色;⑧苏木素复染2～3 min，然后蒸馏水冲洗；⑨封片胶封片、显微镜观察。

2.2 免疫组化评判标准

组织切片中阳性指标是棕黄色或棕褐色颗粒。参考许良中、杨文涛1996年《免疫组织化学反应结果的判断标准》[6]。

2.3 采集免疫组化图像测定平均灰度值

每张切片在显微镜下随机选取5个视野并拍照取图，采用应用丹吉尔灰度软件计算平均灰度值，灰度值数值越高表示阳性表达越低，数值约低，表示阳性表达越高。

2.4 统计方法

3 结果

3.1 免疫组化镜下阳性表现

CD4+、CD8+T细胞、TNF-α、P55阳性信号均为黄色或棕褐色颗粒，CD4+、CD8+T细胞定位于胞浆和胞膜，CD4+T细胞主要在脓腔周表达，CD8+T细胞在病变小叶内表达，TNF-α定位于胞浆，在导管上皮、间质内、浆细胞、多核巨细胞表达，P55定位于细胞间质、细胞膜，在导管上皮、间质内、浆细胞、多核巨细胞、血管内皮细胞表达。见图1。

3.2 不同证型肉芽肿性乳腺炎CD4+、CD8+T细胞、TNF-α、P55表达结果

图1 不同证型中CD4+、CD8+T细胞、TNF-α、P55阳性表达(免疫组化SP法，×400)

表1 不同证型中CD4+、CD8+、TNF-α和P55表达的灰度值

CD4+T细胞在肝郁痰凝证(肿块期)与热毒炽盛证(脓肿期)中表达均高于正虚毒恋证(溃后期)(P<0.05),差异具有统计学意义，在肝郁痰凝证(肿块期)中表达高于热毒炽盛证(脓肿期)，差异无统计学意义(P>0.05)。

CD8+T细胞在正虚毒恋证(溃后期)表达高于肝郁痰凝证(肿块期)与热毒炽盛证(脓肿期)(P<0.05),差异具有统计学意义，在热毒炽盛证(脓肿期)中高于肝郁痰凝证(肿块期)，表达差异无统计学意义(P>0.05)。

TNF-α、P55在肝郁痰凝证表达最明显，热毒炽盛证、正虚毒恋证次之,差异均具有统计学差异(P<0.05)。见图2。

图2 不同证型中CD4+、CD8+、TNF-α和P55表达的灰度值柱状图

3.3 不同证型肉芽肿性乳腺炎CD4+、CD8+T细胞平均灰度值相关性分析

对不同证型肉芽肿性乳腺炎中CD4+、CD8+T细胞平均灰度值进行直线相关性分析，结果显示r=-0.773,P=0.000,即CD4+、CD8+T细胞在不同证型肉芽肿性乳腺炎的表达变化呈负相关，差异有统计学意义，即随着CD4+T细胞表达升高CD8+T细胞表达降低，见图3。

3.4 不同证型肉芽肿性乳腺炎TNF-α、P55平均灰度值相关性分析

对不同证型肉芽肿性乳腺炎中TNF-α、P55平均灰度值进行直线相关性分析，结果显示r=0.835,P=0.000,即TNF-α、P55在不同证型肉芽肿性乳腺炎的表达变化呈正相关，差异有统计学意义，即随着TNF-α表达降低，P55表达降低，见图4。

图3 CD4+T细胞、CD8+T细胞相关性分析

图4 TNF-α、P55相关性分析

3.5 不同证型肉芽肿性乳腺炎T细胞亚群与TNF-α平均灰度值相关性分析

对不同证型肉芽肿性乳腺炎中T细胞亚群与TNF-α平均灰度值进行直线相关性分析，结果分别显示r=0.842,P=0.000,r=-0.864,P=0.000，即在不同证型肉芽肿性乳腺炎TNF-α表达与CD4+T细胞表达呈正相关，与CD8+T细胞表达呈负相关，有统计学意义，见图5、图6。

图5 CD4+T细胞、TNF-α相关性分析

图6 CD8+T细胞、TNF-α相关性分析

4 讨论

肉芽肿性乳腺炎，是指乳腺局限于小叶的非干酪样坏死的肉芽肿性病变，是一类以肉芽肿为主要病理特点的乳腺慢性炎症疾病。该病是一种由各种炎症细胞及细胞因子参与的免疫相关疾病，涉及的细胞及因子包括T细胞、干扰素、肿瘤坏死因子、白介素等[7]。在GLM病变导管内弥漫炎症反应，分泌的一种或多种物质成为抗原，介导IV型超敏反应。有研究发现，在GLM出现浸润的淋巴细胞中,免疫组化显示较多CD3+、CD4+、CD8+细胞浸润，较少的是CD20+，证实为T细胞浸润[8]。ERHAN[9]在评估病人免疫组化时发现18例患者中有14例具有T细胞优势。OGURA等[10]在2例肉芽肿性乳腺炎免疫组化中检测到有CD4或CD8的淋巴细胞浸润病灶处。因此在该病的发生机制中机体自身免疫反应起着重要作用[11]。

CD4+T细胞主要效应功能是分泌细胞因子, 这些细胞因子又可作用于相同的T细胞和其他细胞, 起辅助诱导细胞及体液免疫的作用。CD4+T细胞在自身免疫性疾病的发生和发展中起着最重要的作用, 它们所产生的大部分细胞因子皆为激活免疫反应所必需。CD4+T淋巴细胞功能增强, 机体可发生过强的免疫应答, 导致自身免疫性疾病和超敏反应。CD8+T细胞为抑制/杀伤细胞(Ts/Tc)，有抑制细胞及体液免疫的作用。CD4+细胞和CD8+T细胞之间相互协调和制约，产生适度的免疫应答, 使之既能清除异物抗原, 又不至于损伤自身组织，若CD4+细胞过强，则易导致机体自身免疫疾病[12]，T细胞亚群改变，影响局部细胞免疫，则促进肉芽肿性乳腺炎的发生。

肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α) , 又被称作“恶质素”,是一种重要的促炎细胞因子，具有多种生物学特性，由巨噬细胞、NK细胞、T细胞分泌，促进炎症反应、调节免疫应答，参与细胞增殖与凋亡等。有研究表明, TNF-α在肉芽肿的形成过程中起重要作用,且已有实验模型证实肉芽肿的形成与TNF-α在T细胞的募集密切相关[13]。CD4+、CD8+分泌细胞因子参与免疫应答，在迟发性超敏反应的早期，细胞因子TNF-α及其受体P55表达增加[14]。TNF-α促进其他炎症因子，如IL-2、IL-6等，或可通过诱导下游单核细胞或巨噬细胞等的激活，增加炎症细胞的活性及聚集性，促进其对组织的浸润，导致局部炎症反应，加重损害[12]。

本研究中，CD4+T细胞、TNF-α、P55表达在肝郁痰凝证(肿块期)最高，热毒炽盛证(脓肿期)、正虚毒恋证(溃后期)次之；而CD8+T细胞的表达与其相反。相关性分析结果显示，CD4+、CD8+T细胞二者之间呈负相关；TNF-α与受体P55二者之间呈正相关；在不同证型GLM中，TNF-α、P55表达与CD4+T细胞表达呈正相关，与CD8+T细胞表达呈负相关。

在疾病发生时，自身免疫反应增强，T细胞比例失调，免疫系统紊乱，CD4+T细胞处于高表达状态、CD8+T细胞反之，免疫功能亢进、抑制功能减弱，导致发生过强的免疫应答。疾病进展时，免疫反应先是持续亢进状态，CD4+T细胞水平过高、CD8+T细胞水平降低；在后期，CD4+T细胞表达逐渐降低、CD8+T细胞表达升高，自身免疫反应逐渐降低、抑制自身免疫反应增强，疾病趋于平稳状态，逐渐恢复免疫平衡。因此我们推测，在GLM的治疗过程中, 可从免疫调节剂方面着手, 通过下调CD4+T细胞、上调CD8+T细胞来改变T细胞亚群的比例，从而可削弱这种过强的免疫反应，使CD4+T细胞和CD8+T细胞之间达到平衡，为治疗肉芽肿性乳腺炎乳腺炎提供新的角度。

TNF-α、P55参与了肉芽肿乳腺炎的发生发展，与肉芽肿的形成密切相关。初期疾病严重阶段TNF-α的大量释放，其需与受体结合方能发生作用，因此其受体相应的升高，在疾病的演变中，随着TNF-α的降低，其受体减少。在疾病发展过程中，TNF-α与其受体P55结合，激活相关通路，招募其他炎症细胞如白细胞大量聚集在炎症部位，扩大炎症反应，局部激活血管内皮细胞, 增加血管通透性，损伤局部微循环等。因此我们推测可以在一定程度上抑制TNF-α因子的释放，或可以考虑使用TNF-α抑制剂，干扰相关通路，来缓解GLM的严重程度，达到治疗效果。

综上所述，在GLM不同中医证型中，邪正交争、阴阳盛衰，随着肿块期、脓肿期、溃后期病情演变过程，T淋巴细胞与相关细胞因子亦存在免疫调节变化。T淋巴细胞可产生TNF-α，而TNF-α又可刺激T淋巴细胞产生其他相关因子，进一步促进T细胞增殖分化，共同参与疾病的发生发展。这对肉芽肿性乳腺炎的诊断治疗提供了不同的治疗思路，未来关于GLM的治疗必然会多元化、多靶点、多种治疗手段共同协作。