柞蚕蛹多肽的抗氧化性及稳定性研究

黄静雅 张 禹 朴美兰 魏福安 李晓艳 李喜升

(辽宁省蚕业科学研究所,辽宁凤城 118100)

多肽因其易吸收、安全无毒副作用近年来在保健品市场上大放异彩[1-3]。相关研究表明，一些种类的多肽具有良好的抗氧化性，例如刘雅颀等[4]证实鳄鱼肉多肽具有抗氧化活性；申彩虹[5]从海参的酶解物中分离出两种海参肽，并发现分子量不同的肽会呈现出不同的抗氧化性;闵建华等[6]通过水解桑蚕蛹制备多肽具有较强的抗氧化能力，这些通过蛋白酶的作用水解天然蛋白质的过程温和且高效。在人们日益关注食品安全的如今，高安全性的抗氧化多肽将是人工合成抗氧化剂的有力竞争者，但关于柞蚕蛹多肽的抗氧化性研究却鲜见报道，而有效、无副作用的天然食品级抗氧化剂的研究紧密联系着人类的健康和疾病与衰老的预防，因而筛选出高效安全的抗氧化剂十分必要。

目前测定抗氧化剂抗氧化能力的方法主要是对其各类自由基的清除能力进行考查，本文通过研究柞蚕蛹多肽的体外抗氧化性，测定其DPPH自由基清除能力、还原力、超氧阴离子自由基清除能力和羟基自由基清除能力等，并对其抗氧化稳定性进行研究，综合评价和分析柞蚕蛹多肽的体外抗氧化能力。

1 材料、试剂与设备

磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、抗坏血酸、邻苯三酚、水杨酸、硫酸亚铁、Tris-HCl、过氧化氢、焦性没食子酸等及其他常用试剂均为分析纯。柞蚕蛹多肽粉，实验室自制。仪器设备：PHS-3C雷磁pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司)， ThermoFisherST16R高速冷冻离心机(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)，722s分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)，BZF-50真空干燥箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)，MGC-350HP人工气候箱(江苏中和实验仪器制造有限公司)。

2 试验方法

2.1 柞蚕蛹多肽粉的制备

将柞蚕蛹脱脂蛋白粉按照液料比13∶1加入双蒸水，调节pH为7.0，分别添加蛋白粉质量为1%的中性蛋白酶和1%的复合蛋白酶，在55℃条件下恒温反应8.2 h，煮沸5 min灭酶，5 000 r/min离心10 min后取上清液，即为柞蚕蛹多肽液，真空干燥箱中60 ℃干燥后磨细过80目筛，密封保存于-4 ℃冷藏柜中，待测。

2.2 清除DPPH自由基能力的测定

参照You L[7]的方法稍作改动，用无水乙醇配0.2 mmol/L的DPPH溶液，贮存在棕色试剂瓶中并放入-4 ℃冷藏柜保存。配置一定浓度的柞蚕蛹多肽溶液，取2 mL多肽溶液于试管中加入2 mL无水乙醇。另2 mL多肽溶液于试管中，加入2 mL DPPH(0.2 mmol/L)试剂。以上反应均在震荡均匀后，于室温下避光静置反应30 min，在517 nm处测定吸光值，每个单项实验重复测定3次以上取平均值，以等体积的双蒸水和无水乙醇混合作空白调零。结果计算如下式：

式中：A0为蒸馏水代替样品时测定的吸光 值

Ai为多肽样品与DPPH反应所测定 吸光值

Aj为多肽与无水乙醇反应所得吸光度

2.3 还原力的测定

采用铁氰化钾还原法。配置不同浓度的柞蚕蛹多肽溶液，取1 mL于试管中，加入1 mL 0.2 mol/L磷酸缓冲液(pH 6.6)和1 mL 1%的铁氰化钾混合均匀，在50 ℃的恒温水浴锅中保持20 min后迅速冷却，加入1 mL 10%的三氯乙酸(TCA溶液)，混合均匀后于4 000 r/min离心10 min，量取1 mL上清液，依次加入1 mL双蒸水和1 mL 0.1%的FeCl3溶液，混合均匀室温下静置10 min，以蒸馏水作为空白调零，在分光光度计700 nm处测量其吸光值，吸光值越大表示还原能力越强，以抗坏血酸作为对照。

式中：A0为以蒸馏水代替样品时吸光值

2.4 超氧阴离子自由基清除能力的测定

采用Li Xican[8]的邻苯三酚法。配置不同浓度的柞蚕蛹多肽样品溶液，每个浓度样品取1 mL加入试管中，加入1.95 mL 0.05 mol/L的Tris-HCL缓冲液(pH 8.2，含1 mmol/L乙二胺四乙酸二钠)，混合均匀后在37 ℃恒温水浴锅中温浴，加入50μL的60 mmol/L邻苯三酚(溶于1 mmol/L盐酸中)，快速混合(上下颠覆式)，开始计时，每30 s读取吸光值1次(325 nm处)，300 s时结束。以Tris-HCl代替样品溶液作为空白参比。超氧离子清除率计算式如下：

式中：ΔA样=A样300s-A样30s

ΔA0=A0300s-A030s

2.5 羟基自由基清除能力的测定

参照Huang X等[9]的水杨酸法测定并稍作改动配置不同浓度的柞蚕蛹多肽样品，每个样品量取10 mL置于试管中，分别向试管中加入1 mL水杨酸(9.0 mmol/L)、1 mL H2O2(8.8 mmol/L)和1 mL的硫酸亚铁(9.0 mmol/L),在37 ℃下恒温水浴反应30 min后，于分光光度计510 nm处测量其吸光值，每个实验重复3次取平均值，相同条件下以抗坏血酸做为对象进行对比试验，羟基清除率计算式如下：

式中：A0为用10 mL双蒸水代替多肽样 品代替所得吸光值

Ax0为多肽样品在510 nm处的吸光值

Ax为多肽样品不加显色溶液的吸光值

2.6 酸碱稳定性测定

取1 mg/mL的柞蚕蛹多肽粉配置成适量浓度的溶液，用1 mol/L的HCl和1 mol/L的NaOH调节溶液pH分别为2.0、4.0、6.0、8.0、10.0，将体积补足至5 mL，置于37 ℃超级恒温器中，放置时间分别为1 h、2 h、3 h时取样，立刻用pH 7.0的缓冲液将样品pH调节至7.0，测定柞蚕蛹多肽抗氧化性，计算DPPH清除率，测定方法同2.2。

2.7 光稳定性测定

称取柞蚕蛹多肽配成1 mg/mL溶液10份，分别用透明PE自封袋包装好，5份置于人工气候箱(模拟太阳光模式)和5份放在暗处避光(密闭不透光的暗箱)保存15 d，期间每隔3天取出一份测定柞蚕蛹多肽DPPH自由基清除能力。

2.8 热稳定性测定

将1 mg/mL柞蚕蛹多肽溶液分成几份放置在恒温水浴锅中，用食品专用温度计测量溶液的中心温度分别达到30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃中，保持30 min后，冷却至室温测定多肽的DPPH清除能力。

2.9 金属离子稳定性测定

用双蒸水配置1 mg/mL柞蚕蛹多肽溶液，分别添加1 mg/mL的CaCl2，KCl、FeCl3、CuCl2、ZnCl2、MgCl2、NaCl，常温下反应1 h后，测量柞蚕蛹多肽的DPPH自由基清除能力，重复3次平行实验。

2.10 食品添加剂稳定性测定

配置1 mg/mL的柞蚕蛹多肽溶液，在溶液中分别添加质量分数为1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%的NaCl，0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.1%、0.12%柠檬酸，1.0%、2.0%、4.0%、6.0%、8.0%、10.0%白砂糖；室温下放置1 h后测定其多肽DPPH清除率。

2.11 防腐剂稳定性测定

配置1 mg/mL的柞蚕蛹多肽溶液，在溶液中分别添加质量分数为0.02%、0.04%、0.08%、0.10%、0.12%、0.14%、0.16%的苯甲酸钠和山梨酸钾，在室温下放置1 h后测定其多肽的DPPH清除率。

2.12 体外模拟胃肠消化

2.12.1 模拟胃消化试验 将柞蚕蛹多肽配置成10 mg/mL的溶液，用0.5 mol/L HCL调节pH至2.0，37 ℃恒温水浴20 min模拟体内胃环境，此时按底物质量的2.5%加入胃蛋白酶，37 ℃温浴并不断搅拌2 h，用0.5 mol/L的NaOH调节pH至7.5终止反应，取适量消化液测定DPPH清除能力。

2.12.2 模拟肠消化试验 将胃消化后的液体按底物的4%加入胰酶，使之在37 ℃条件下恒温反应2 h，反应过程不断搅拌，待试验结束将反应体系加热至85 ℃持续20 min灭酶，测定消化液的DPPH清除率。

3 结果与分析

3.1 DPPH清除能力试验结果

由图1所示，在浓度从0.5 mg/mL至4 mg/mL范围内，多肽浓度越高其DPPH的清除能力越强；当浓度大于4 mg/mL，继续增大多肽浓度DPPH自由基的清除能力也不会有太大变化，此时视觉上反应体系均褪色完全。蚕蛹多肽和抗坏血酸的IC50值分别为0.86 mg/mL和0.93 mg/mL。实验结果表明，柞蚕蛹多肽具有清除DPPH自由基的能力，蚕蛹多肽浓度越高其DPPH清除率越高；当蚕蛹多肽浓度为4 mg/mL时清除率最高，为61.3%，这一数值小于张辉[10]的麦麸多肽研究结果,可能是因为后者采用了超声辅助酶解的原因。

3.2 还原能力试验结果

如图2所示，在柞蚕蛹多肽浓度0.05～1.0 mg/mL的范围内，还原力随着多肽浓度增大由初始的8.37%快速提高到93.02%，与抗坏血酸还原能力不断接近；此后增大多肽浓度虽然还原力会提高但提升幅度有限，柞蚕蛹多肽的还原力在8 mg/mL浓度下还原力为97.11%，达到最大值。

3.3 超氧阴离子自由基清除能力试验结果

由图3可知，柞蚕蛹多肽的超氧阴离子自由基清除能力随多肽的浓度的增加呈现增长趋势；在蚕蛹多肽浓度由0.5 mg/mL增加到8 mg/mL的过程中，其超氧阴离子清除率由18.69%增加至82.62%，此时的超氧阴离子自由基清除率达到最大；继续增大柞蚕蛹多肽的浓度，清除率也不会提高。柞蚕蛹多肽和抗坏血酸对超氧阴离子自由基清除率IC50值分别为3.23 mg/mL和0.13 mg/mL。实验结果表明，柞蚕蛹多肽有良好的超氧阴离子自由基清除能力。

3.4 羟基清除能力试验结果

从图4可以看出，柞蚕蛹多肽浓度由0.5 mg/mL逐渐提高到2 mg/mL的过程中，蛹多肽的羟基自由基清除能力随多肽的浓度增加而迅速提高，由初始的43.7%提高到了91.95%；柞蚕蛹多肽浓度继续增大，其羟基清除能力缓慢提高至逐渐接近抗坏血酸，当蚕蛹多肽浓度为8 mg/mL时其羟基清除率为98.35%，与抗坏血酸的最高清除率98.55%较为接近，柞蚕蛹多肽的羟基自由基清除率的IC50值为1.02 mg/mL。

3.5 pH值对稳定性的影响

由图5可知，柞蚕蛹多肽在酸性至近中性条件下有良好的稳定性，当pH为2～6时，柞蚕蛹多肽的DPPH清除率始终保持在90%左右，pH=6时，柞蚕蛹多肽的1 h清除率达到最高值95.19%，可能是此时的清除活性反应体系里酸中存在的游离氢离子和多肽共同的作用。pH值继续提高，清除能力迅速下降，在pH值分别为8和10的条件下，蛹多肽的清除率分别为66.0%和49.97%。pH值为8时，柞蚕蛹多肽放置2 h后DPPH清除率比放置1 h后下降了52%；而在pH为10时，柞蚕蛹多肽在37 ℃温度下放置2 h以上几乎不具备清除能力，这表明在强碱性环境中柞蚕蛹多肽的肽链发生了消旋反应，使其分子构象发生了改变从而影响其活性[11]。因此在实际应用过程中，为保证柞蚕蛹多肽的抗氧化稳定性，应在酸性至中性范围内处理较为适宜，且热处理时间不能过长。

3.6 光照对柞蚕蛹多肽稳定性的影响

相关文献报道，蚕丝蛋白质会在光照作用下氧化，使肽链上的氨基酸等发生光降解，这些变化会引起丝蛋白的泛黄和受损[12]，可见肽链上的氨基酸对光敏感，因此基于肽链的这一特点进行柞蚕蛹多肽的光处理试验可研究蛹多肽的光稳定性。

如图6所示，和对照组相比，光照使柞蚕蛹多肽DPPH自由基清除能力下降，光照时间越长，清除能力下降越多；光照3天后，清除率迅速由69.6%下降至27.54%，继续光照清除率缓慢下降，给予12 d光照后柞蚕蛹多肽DPPH自由基清除率下降至18.45%，此时对照组的清除率为40.83%，说明在长时间的光照使柞蚕蛹多肽的光稳定性出现一定程度的降低。

3.7 温度对柞蚕蛹多肽稳定性的影响

由图7可知，热处理会降低柞蚕蛹多肽的DPPH自由基清除活性，温度越高，清除率越低，当温度升高至80 ℃时，DPPH清除率低至50.13%，这可能是由于对于蛋白质变性而言，温度每升高10 ℃，反应速率增加约600倍[13]，使柞蚕蛹多肽在80 ℃条件下的变性更快，失活时间更短。

3.8 金属离子对柞蚕蛹多肽稳定性的影响

从图8可知，不同种类的金属离子对柞蚕蛹多肽有不同程度的影响，DPPH自由基清除率的顺序为Fe3+

3.9 食品添加剂对柞蚕蛹多肽的稳定性影响

氯化钠对柞蚕蛹多肽DPPH自由基清除率的影响如图9(a)显示，当NaCL添加量在1%～6%范围内，柞蚕蛹多肽的清除率由65.24%提高到79.53%，但是变化幅度不大；结果表明当氯化钠的添加量低于6%时，对柞蚕蛹多肽的稳定性无显著影响，这一趋势同张晶[16]所报道的结果一致。

由图9(b)可知，添加柠檬酸会使柞蚕蛹多肽DPPH自由基清除能力提升，这是由于柠檬酸分子的羟基结构对抗氧化剂起到稳定的作用，且其本身也具有抗氧化活性，因而表现出增效的作用；但随着柠檬酸浓度越来越大，提高幅度却随之降低。

由图9(c)可知，白砂糖添加量的多少对柞蚕蛹肽DPPH清除率影响不显著，当白砂糖浓度在1%～10%范围内，柞蚕蛹多肽对DPPH的清除率始终保持在70%左右。可以认为，柞蚕蛹多肽在白砂糖的作用下活性较为稳定。

3.10 防腐剂对柞蚕蛹多肽稳定性的影响

由图10可知，对柞蚕蛹多肽的影响，苯甲酸钠>山梨酸钾；苯甲酸钠添加量从0.02%增加至0.16%，柞蚕蛹多肽的DPPH自由基清除能力从79.95%减低到53.46%；山梨酸钾作用于柞蚕蛹多肽DPPH清除率的浮动较小，当山梨酸钾添加量从0.02%加至0.16%，柞蚕蛹多肽的清除率从61.58%降低至55.35%。可能是因为DPPH是脂溶性，而苯甲酸钠的特点是亲油性较强，因而能够迅速作用于其反应体系中，使溶液褪色；虽然添加苯甲酸钠的柞蚕蛹多肽最高清除率大于添加山梨酸钾的多肽，但已证实长期食用苯甲酸钠会对人体造成一些潜在危害，在我国，苯甲酸钠主要用于食醋、酱油和口服液的应用，山梨酸钾的毒性要比苯甲酸钠小，许多国家已逐步采用山梨酸和山梨酸钾替代苯甲酸和苯甲酸钠[17]，因此在柞蚕蛹多肽类产品的生产中，应根据实际需求合理的选用适宜的防腐剂。

3.11 体外模拟胃肠消化试验结果

由图11可知，柞蚕蛹多肽具有良好的DPPH清除能力，经体外模拟胃肠消化环境试验，其DPPH清除率逐渐降低；经胃消化阶段其清除率由59.09%降低至24.05%，再经肠消化后又下降至9.4%；实验结果表明，整个体外模拟胃肠消化降低了DPPH的清除率，表明柞蚕蛹多肽的胃肠消化抗氧化稳定性较低。

4 结 语

随着生活水平的不断提高，人们对食品要求不仅限于温饱，而是追求更高的营养性、强身健体等目标。柞蚕蛹是一种年产量较高，但开发程度非常低的产品。本文初步证明了柞蚕蛹多肽具有体外抗氧化性，在一些条件下抗氧化稳定性也较好，合理利用将会为保健品、食品行业提供成本合理、数量众多的原料，也为柞蚕蛹多肽的新产品研究提供理论依据。