复合菌分步发酵大豆皮对其抗营养因子降解效果的影响

彭 翔，韩 丽，张广民，严 峰，李 阳，王海燕，蔡辉益，2

（1.北京挑战生物技术有限公司，北京 海淀 100081；2.中国农业科学院饲料研究所，北京 海淀 100081）

随着我国玉米、豆粕等常规饲料原料资源紧缺，越来越多的饲料企业大量使用价格低廉的非常规饲料原料，包括农作物秸秆、麸皮、大豆皮、统糠等。在这些非常规饲料原料中，农作物秸秆营养价值低，不利于畜禽生长；麸皮粗纤维含量较高，但膳食纤维含量相对较低，含水量较高，不利于储存，且霉菌毒素含量超标；统糠木质素含量高，不易消化，且易划伤畜禽肠道。而大豆皮作为新型的膳食纤维饲料原料，具有木质素含量低、膳食纤维含量高、且霉菌毒素含量少等优势（胡金杰等，2015）[1]，其水分含量低于10%，木质素含量低于2%，粗纤维约37%，膳食纤维约75%，粗蛋白质约12%，其干物质消化率高达90%，与农作物秸秆、麸皮、统糠等非常规饲料原料相比，具有较好的使用优势。有报道称，大豆皮作为较好的纤维饲料原料，可在猪后肠发酵产生短链脂肪酸为机体提供能量，提高饲料中的营养物质利用率，促进家畜生长等（胡金杰等，2015）[1]；大豆副产物中的异黄酮可增加母猪产活仔数，提高动物的繁殖性能，同时在解决母猪便秘和仔猪腹泻等问题上发挥着重要的作用（曲强，2018）[2]。但由于大豆皮中含有球蛋白、β-伴大豆球蛋白和胰蛋白酶抑制因子等多种抗营养因子，导致其利用率低，动物生长减缓，使其在养猪业上的生产应用受到一定限制。采用微生物发酵法去除抗营养因子是目前国内外研究的热点（Wang等，2014）[3]。有报道称，微生物发酵大豆副产物可消除其抗营养因子，并产生多肽、乳酸、消化酶、维生素等多种活性物质，提高原料营养价值（谢益根等，2016）[4]。因此，本研究采用固体发酵技术考察耗氧和厌氧相结合的发酵模式来发酵大豆皮，旨在研究此发酵工艺模式对大豆皮中抗营养因子降解效果、发酵大豆皮产品品质和产品稳定性的影响，并筛选出较佳的发酵参数，以提高大豆皮的营养价值和饲用价值，为开发功能性膳食纤维发酵饲料提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验时间与地点

试验于2019年8—12月在天津市蓟州区挑战集团研究院进行。

1.2 试验材料

试验用菌主要有枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、酿酒酵母菌，均由北京挑战生物技术有限公司提供。试验用大豆皮由秦皇岛金海粮油工业有限公司提供。试验用培养基包括胰蛋白胨、酵母浸出粉、氯化钠、葡萄糖、MRS培养基、碳源（糖蜜）、氮源（尿素）等。

1.3 试验方法

1.3.1 试验设计 复合菌分步发酵大豆皮主要包括第1阶段的耗氧发酵和第2阶段的厌氧发酵大豆皮。其中第1阶段耗氧发酵大豆皮工艺的筛选和优化主要包括发酵剂组合（碳源和氮源添加比例）和单菌发酵大豆皮工艺条件的筛选和优化（包括发酵时间、温度、含水量和接种量等），其主要检测指标包括球蛋白、β-伴大豆球蛋白和胰蛋白酶抑制因子降解率等指标，并根据上述指标的发酵效果确定较佳的大豆皮发酵工艺参数。第2阶段厌氧发酵大豆皮主要是第1阶段耗氧发酵结束后，接种植物乳杆菌和酿酒酵母菌进行厌氧发酵，以改善发酵料气味和发酵大豆皮品质，主要检测指标包括乳酸和pH等。

1.3.2 指标测定及检测方法 按照GB/T 6435—2014的方法进行干物质测定；按照GB/T 6432—2018的方法进行粗蛋白质测定；按照GB/T 8622—2006的方法进行脲酶活性测定；按照ELISA（酶联免疫吸附试验）检测试剂盒（由北京龙科方舟生物工程技术有限公司提供）说明进行抗营养因子（球蛋白、β-伴大豆球蛋白和胰蛋白酶抑制因子）的快速定量检测及计算；采用生物传感分析仪进行乳酸含量测定；采用pH计进行发酵料pH测定。

1.3.3 菌株活化 将实验室保存的枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌和酿酒酵母菌菌种按1%体积分别接种于LB培养基、MRS培养基或PDA培养基中，37℃或30℃活化22 h后，按同样的方式进行二次扩培，获得多种菌株的菌液并调OD值，且对稀释好的菌液进行涂板计数，确定菌量，备用。

1.3.4 发酵剂组合中氮源和碳源添加比例的筛选在待发酵大豆皮中接种10%的芽孢杆菌菌株，并补充不同添加比例的氮源和碳源（3∶1、10∶3、4∶1、15∶4和5∶1），混合均匀后，装入三角瓶中，加盖封口膜，置于恒温培养箱中37℃耗氧发酵72 h，发酵结束后按照GB/T 14699.1—2005采样，于55℃烘干粉碎，用于发酵大豆皮中抗营养因子指标的测定。最后根据测定结果进而筛选较佳的碳源和氮源添加比例。

1.3.5 耗氧发酵大豆皮工艺条件的筛选和优化 根据1.3.4筛选结果进行第1阶段的耗氧发酵大豆皮的发酵时间（24 h、48 h和 72 h）、发酵温度（37℃、30℃、25℃）、含水量（50%、45%和 40%）、接种量（0.1%、1%和10%）等发酵参数的筛选和优化。其中，以发酵时间48 h、发酵温度37℃、含水量45%、接种量1%为耗氧发酵试验开始时的基础参数，发酵结束后，测定发酵大豆皮中抗营养因子含量，并计算其降解率，后期试验根据前期试验所得结果进行相关单因素调整。

1.3.6 厌氧发酵大豆皮工艺条件的筛选和优化 待第1阶段耗氧发酵结束后，向发酵大豆皮中接种植物乳杆菌和酿酒酵母菌继续进行厌氧发酵。其中，根据前期实验室研究结果，设定发酵温度为30℃，植物乳杆菌与酿酒酵母菌接种比例为100∶1，并对发酵时间（24 h、48 h和72 h）进行筛选和优化，厌氧发酵结束后，测定发酵产物中乳酸含量和pH，并观察发酵料颜色和气味，确定较优的厌氧发酵工艺参数。

1.4 统计分析

试验数据采用Excel 2010进行数据统计，用SPSS 18.0软件进行单因素方差分析和多重比较，数据均以平均值±标准误表示，其中P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同碳氮比对大豆皮抗原蛋白降解效果的影响

由表1可知，固态发酵试验中，在大豆皮发酵体系中加入不同比例的碳源和氮源发现，大豆皮发酵结束后，碳氮比为15∶4时，其球蛋白、β-伴大豆球蛋白和胰蛋白酶抑制因子降解率与其他组相比相对较好（P<0.05），其降解率分别为92.90%、86.29%和79.87%。因此，选用碳氮比为15∶4进行接下来的试验。

2.2 耗氧发酵工艺条件对其抗原蛋白降解效果的影响

由表2可知，通过测定不同发酵时间（24 h、48 h和72 h）发酵大豆皮中抗营养因子发现，发酵48 h和72 h时大豆皮抗营养因子降解率显著高于发酵24 h（P<0.05），且发酵72 h大豆皮抗营养因子降解率显著高于发酵48 h（P<0.05），但从抗营养因子含量上看两者差异不大。因此，为了缩短发酵时间，减少生产成本，后期试验选择发酵大豆皮48 h为宜。

表1 不同碳源和氮源组合对大豆皮抗营养因子降解效果的影响

表2 耗氧发酵对大豆皮抗原蛋白降解效果的影响

通过测定不同发酵温度（37℃、30℃和25℃）对大豆皮抗营养因子降解效果的影响发现，随着发酵温度的提高，其球蛋白、β-伴大豆球蛋白和胰蛋白酶抑制因子降解率逐渐升高，且三者间差异显著（P<0.05），尤其以发酵温度为37℃发酵效果较优。

通过测定不同发酵含水量（40%、45%和50%）对大豆皮抗营养因子降解效果的影响发现，随着发酵体系含水量的不断增加，其球蛋白、β-伴大豆球蛋白和胰蛋白酶抑制因子降解率逐渐升高，且三者间存在显著差异（P<0.05），尤其以发酵含水量为50%时发酵效果较优。

通过测定发酵大豆皮不同接种量（0.1%、1%和10%）对大豆皮抗营养因子降解效果的影响发现，随着发酵大豆皮接种量的不断增加，其球蛋白、β-伴大豆球蛋白和胰蛋白酶抑制因子降解率随之增加（P<0.05），以发酵体系10%接种量发酵效果较优，但从抗营养因子含量上看，接种量10%与接种量1%差异不明显，又考虑菌种成本，因此选择后期发酵试验接种量1%为宜。

2.3 厌氧发酵工艺条件对大豆皮发酵效果的影响

本试验根据2.2筛选结果进行耗氧发酵，并在耗氧发酵结束的发酵大豆皮中接种植物乳杆菌和酿酒酵母菌继续进行厌氧发酵。由表3可知，大豆皮耗氧发酵结束后，其球蛋白、β-伴大豆球蛋白、胰蛋白酶抑制因子降解率分别为86.60%、85.04%和82.76%。脲酶活性由0.85 U/g降低至0.10 U/g。

表3 耗氧发酵对大豆皮抗营养因子降解效果的影响（n=6）

由表4可知，随着厌氧发酵时间的延长，发酵产物中乳酸含量不断增加，pH不断降低，且厌氧发酵48 h和72 h乳酸含量和pH显著优于厌氧发酵24 h（P<0.05），但从两者数值上看，厌氧发酵48 h与72 h变化幅度不大，因此考虑成本选择厌氧发酵48 h为宜。

表4 厌氧发酵不同发酵工艺参数对大豆皮发酵效果的影响（n=6）

3 讨论

大豆皮主要成分是纤维和果胶，其营养组成比较单一，含氮物质较少，不利于发酵菌株的生长，而碳源和氮源是微生物生长所必须的营养物质（张开磊等，2015）[5]。因此，本试验研究了不同碳氮比对大豆皮抗营养因子降解效果的影响，结果发现，随着大豆皮发酵体系中碳氮比的增加，其抗营养因子降解率呈先升高后降低的趋势，尤其当碳氮比为15∶4时，发酵大豆皮中抗营养因子降解率较高。这可能是此碳氮比更有利于发酵菌株的生长和代谢。另外发现，随着尿素水平的增加，发酵大豆皮中有明显的刺鼻性气味。可见，尿素添加水平过高将会影响发酵大豆皮的产品品质。

微生物发酵过程中可产生多种消化酶和有益活性成分，以改善发酵原料的营养物质利用率和饲用价值。而微生物发酵参数和生产工艺是影响微生物生长繁殖、发酵饲料产品质量和产品稳定性的主要因素（高斐斐等，2015）[6]。其中，发酵温度是影响发酵料发酵效果和微生物的生长及其代谢产物合成的关键控制点。本研究发现，随着发酵温度的升高，其抗营养因子降解率逐渐升高，尤其大豆皮发酵温度为37℃时其发酵效果较优。这与袁正武等研究结果基本一致（袁正武等，2015）[7]。这可能是因为最适发酵温度受发酵底物和发酵菌种等因素的影响，不同菌种在不同温度下生长代谢状况不同，而在此温度条件下枯草芽孢杆菌产酶能力较强，有利于大豆皮中抗营养因子的降解（李锡阁等，2019）[8]。

发酵体系含水量与发酵菌种和发酵原料等直接相关，其适宜含水量不仅有利于微生物生长及其代谢产物的产生，还能保证发酵饲料的发酵效果。本研究中随着发酵体系含水量的增加，其抗营养因子降解率呈逐渐增加的趋势，尤其以50%含水量发酵效果最优，这与李锡阁等和王金斌等研究结果基本一致（李锡阁等，2019；王金斌等，2009）[8-9]。这可能是因为微生物发酵过程中可使发酵原料中的碳水化合物等物质分解，产生一些黏性物质，使底物黏连，而随着发酵体系水分的不断增加，这种底物黏连作用减弱；又因为高水分环境适合枯草芽孢杆菌生长，随着其活性的增强，有利于其代谢产生降解抗营养因子的酶类。

发酵菌种接种量影响原料发酵过程中微生物之间的动态平衡，而适宜的接种量不仅可抑制发酵体系中杂菌的生长，同时还可缩短发酵周期，提高微生物代谢产物的产生量，进而改善发酵饲料的产品品质。本研究发现，随着发酵大豆皮接种量的不断增加，其抗营养因子降解率随之增加，但从抗营养因子含量上看，接种量10%与接种量1%差异不大。这说明接种量为1%时就可达到预期发酵效果，还可降低菌种使用成本。这与Seo等（2016）[10]研究结果基本一致。这可能是由于芽孢杆菌在发酵过程中产生了大量的蛋白酶，降解了大豆皮中大多的抗营养因子。

发酵时间可影响芽孢杆菌菌株的生长和产物酶的活性。本研究发现，随着发酵时间的延长，发酵大豆皮中抗营养因子降解率逐渐升高，尤其发酵72 h时其抗营养因子降解率达到最高，这可能是因为微生物对大豆皮的发酵主要依赖于其所产生的各种酶类，而随着发酵时间的延长，枯草芽孢杆菌生长并产生了较多的功能性酶，降解了其中的抗营养因子，提高其饲料利用率（Dai等，2019）[11]。另外，本研究还发现，发酵72 h时其抗营养因子含量与发酵48 h变化不大，这说明延长发酵时间对其抗营养因子含量无明显变化。这可能是因为枯草芽孢杆菌属于好氧菌，随着发酵时间的延长，发酵体系中氧气的缺乏导致芽孢杆菌菌株减少，从而影响蛋白酶的分泌。由于固体耗样发酵时间过长可能会有染霉风险，不利于储存，且适口性差，生产成本较高。因此，如何提高发酵料产品品质是接下来的研究方向。

有报道称，乳酸菌发酵过程中产生的酶类可降解碳水化合物，并产生细菌素、乳酸和其他有机酸等物质，不仅能抑制有害菌生长，降低发酵体系pH，提高酸度，减少染杂菌风险；还能改善动物肠道健康，增强肠道功能（魏炳栋等，2014）[12]。本研究中大豆皮经乳酸菌和酵母菌厌氧发酵后，其在发酵0～48 h乳酸含量和pH均变化迅速，而后趋于稳定，且气味和适口性均明显改善，可减少杂菌污染，提高产品稳定性，延长产品储存时间。这与魏炳栋等（2014）[12]和刘国娟等（2014）[13]研究结果基本一致。这可能是因为植物乳杆菌和酿酒酵母菌可利用发酵过程中产生的单糖或二糖等，产生有机酸、醇类或酯类等酸香味物质，降低了发酵大豆皮体系pH，抑制了杂菌的生长，起到提高发酵饲料的诱食性，改善发酵料产品品质的作用（魏炳栋等，2014）[12]。可见，在发酵体系中接种乳酸菌和酵母菌进行厌氧发酵可解决发酵料适口性和产品稳定性等问题。

4 结论

在本试验条件下，采用复合菌分步发酵模式，综合研究了不同碳氮比和发酵参数对抗原蛋白降解情况的影响，发现碳氮比为15∶4，耗氧发酵工艺参数为发酵时间48 h、发酵温度37℃、含水量50%，枯草芽孢杆菌接种量1%时，其对大豆皮发酵效果较优，可有效消除其抗营养因子，提高其饲用价值；厌氧发酵工艺参数为植物乳杆菌∶酿酒酵母菌为100∶1，发酵时间48 h，发酵温度30℃，其可改善发酵饲料气味和适口性，减少染霉风险，且提高了发酵料品质和产品稳定性，可作为优质功能性膳食纤维发酵饲料应用于动物生产中，以实现大豆皮高效利用。