鲁西北地区仔猪大肠杆菌病流行病学调查和耐药性分析

庞丽丽，王怀中，呼红梅，朱荣生，王建才，刘兴华，黄保华

（1.山东省农业科学院畜牧兽医研究所，山东 济南 250100；2.青岛农业大学动物医学院，青岛 266000）

大肠埃希氏菌（Escherichia coli）是兼性厌氧菌，属于肠杆菌科，革兰氏染色呈阴性、无芽孢、可以分解葡萄糖，是人和动物后肠段的正常菌群之一。目前已经清楚的血清型数量有近千种，绝大部分血清型无病原性或为条件致病菌，少部分已知血清型为条件性致病菌，其中产肠毒素大肠杆菌（Enterotoxi genic E.coli,ETEC）是造成初生仔猪发病的主要病原菌[1]，其分泌的黏着素性菌毛和肠毒素可导致仔猪黄白痢和水肿病，主要表现为腹泻、脱水、急性死亡等。时至今日，大肠杆菌病仍然是养猪业的一个多发疾病[2-4]。现今国内养猪业仍以抗生素疗法为最常用的预防及治疗方法，但抗生素等药物的不合理使用造成了耐药性大肠杆菌的快速产生和扩散，直接导致了细菌性疾病治愈的困难。

为了解鲁西北地区规模化猪场的仔猪大肠杆菌病流行情况，2018年10月从某市12家规模化猪场中了解到有7家猪场频发仔猪腹泻，于是从此7家猪场中采集发病仔猪病料分离大肠杆菌，并对分离的菌株进行血清型鉴定及耐药性检测，从实验室诊断方面为地方大肠杆菌的防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 病料来源

2018年10月从鲁西北地区的7家临诊发生仔猪腹泻的规模猪场中，采集60日龄内发病腹泻仔猪的肛试粪样，共24份病料。

1.2 主要试剂

伊红美蓝培养基（EMB）、麦康凯培养基（MAC）、SS培养基、营养琼脂培养基、肉汤培养基（MHB）、肉汤琼脂培养基（MHA）均购自北京路桥技术有限责任公司；革兰氏染色试剂盒购自雷根生物；药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司；大肠杆菌成套生化鉴定管（DCSN）购自海博生物；大肠埃希氏菌诊断血清、常见的30种大肠杆菌抗原血清购自宁波天润生物有限公司。

1.3 试验动物

Balb/c小鼠18～20 g，60只，由山东大学实验动物中心提供。

1.4 细菌的分离纯化培养

在无菌超净工作台内将采集的病料采用四区划线法接种于麦康凯培养基上，37℃培养过夜后，挑取粉红色的疑似大肠杆菌菌落接种至普通培养基上纯化，挑取纯化后的疑似大肠杆菌同时接种至伊红美蓝培养基和SS培养基上，观察菌落生长情况，筛选出符合大肠杆菌细菌学形态的菌株。对筛选出的菌株进行革兰氏染色，镜检，取革兰氏染色反应符合大肠杆菌特征的菌株用进行大肠杆菌生化鉴定。

1.5 大肠杆菌生化鉴定

按照肠杆菌成套生化鉴定管（DCSN）说明书操作。

1.6 大肠杆菌血清型鉴定

将纯化后的待检大肠杆菌菌株接种于营养琼脂斜面，37℃恒温培养24 h后，用无菌生理盐水洗涤、离心重复2次制成浓菌液，用大肠杆菌标准血清对所分离到的大肠杆菌进行血清型鉴定，操作按照说明书进行。

1.7 分离菌的16S rDNA PCR鉴定

挑取纯化后的典型单个菌落接种到MHB中，200 r/min 37℃恒温震荡培养12 h形成种子液，再按1%比例进行接种至MHB中继续摇菌4～6 h，用煮沸法快速制作DNA模板，然后进行PCR扩增16S rDNA基因，引物为16S rDNA通用引物。反应条件：94℃4 min；94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，35次循环；72℃10 min。PCR产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测，预扩增片段1 467 bp。PCR产物由上海生工生物工程技术服务有限公司测序，序列结果用NCBI Blast搜索比对，鉴定标准按照同源性≥97%判定。

1.8 致病性试验

筛选出为致病性血清型的大肠杆菌分别挑取单个菌落接种至5 mL普通肉汤培养基中，37℃恒温震荡（200 r/min）12 h为种子液，然后按1%比例将种子液接种至MHB中，继续37℃震荡培养4～6 h，检测OD值稀释细菌约109CFU/mL后对小鼠进行腹腔注射，每株菌注射3只，每只注射0.5 mL；同时设置空白对照组，用等量无菌生理盐水代替菌液腹腔注射小鼠，观察小鼠1周内的发病以及死亡情况。对死亡小鼠进行剖检，观察病理变化，并且在无菌条件下采集肝脏组织分离检测细菌。

1.9 药敏试验

用分离到的致病菌株进行药敏试验，按照常规药敏纸片扩散法进行操作，每株菌的药敏试验做3次重复，以没有明显肉眼可见物区域为抑菌圈边缘，用标尺准确测量抑菌圈直径大小，每种药敏试纸片抑菌圈的大小取3次重复的平均值。判断标准参照美国临床实验室标准委员会（NCCLC）标准，级别分为耐药（R）、中度敏感（I）和高度敏感（S）。判断标准为抑菌圈直径≤10 mm为不敏感即耐药，10 mm＜抑菌圈直径＜20 mm为中度敏感，抑菌圈直径≥20 mm为高度敏感。

药敏片药敏片选用常用的10种抗菌药敏片：氧氟沙星（OFX，5 μg）、头孢曲松（CRO，30 μg）、克拉霉素（CLA，15 μg）、阿米卡星（AMK，30 μg）、大观霉素（SH，100 μg）、林可霉素（MY，10 μg）、环丙沙星（CIP，5 μg）、青霉素（P，10 μg）、阿莫西林（AMX，10 μg）、头孢唑啉（KZ，30 μg）。

2 结果与分析

2.1 细菌分离与培养

从采集的病料中共分离具有以下特征的细菌：麦康凯培养基上生长呈粉红色菌落；挑取以上疑似的典型菌落，接种在普通琼脂平板上进行纯化，生长均呈灰白色、半透明、表面隆起、光滑湿润、边缘整齐的圆形菌落；纯化后的菌落接种至伊红美蓝培养基和SS培养基上，筛选出在伊红美蓝培养基中生长呈现金属光泽，以及在SS培养基上生长呈现粉红色菌落的23株细菌，然后经涂片、染色、镜检，均可见形态一致的两端钝圆、中等大小的革兰氏阴性杆菌，见图1。

2.2 细菌生化鉴定

经生化鉴定筛选出的23株疑似大肠杆菌均为大肠杆菌。

2.3 致病性试验

将筛选出的23株大肠杆菌以109CFU/mL浓度对Balb/c小鼠进行腹腔注射接种，23株细菌均致小鼠死亡，阴性对照组小鼠健康，说明均为致病菌株。剖检病鼠可见肝脏肺脏充血、小肠出血等病理变化（图2和图3）。无菌条件下采取发病死亡小鼠肝脏组织进行细菌分离，经鉴定均为大肠杆菌。

2.4 大肠杆菌血清型鉴定结果

采用玻板凝集试验，对分离的23个致病菌株进行鉴定分型。结果显示，分离株血清型分属于9种血清型，其中优势血清型是O157、O113，优势血清型菌株分别占已鉴定菌株的 30.4%（7/23）、21.7%（5/23）。

2.5 16S rDNA基因的PCR扩增与测序

将PCR产物通过2%琼脂糖凝胶电泳检测，用凝胶成像仪可看到菌液样品在1 000 bp和2 000 bp间出现条带，与预期的目的片段大小（1 467 bp）相符（图4）。

将PCR产物送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，序列比对结果表明，所有菌株的扩增序列与GenBank中大肠杆菌参考株16S rDNA基因序列的同源性均达到99%。

2.6 药敏试验

选用目前临床上常用的10种抗菌药对23株大肠杆菌进行药敏试验，结果发现，同时对3种及以上抗菌药耐药的多重耐药分离菌株占87.0%（20/23）。抑菌效果的判定参考中华人民共和国卫生行业标准WS/T 650—2019，此处统计高度敏感和中度敏感菌株数量，得出结果抑菌效果较好的药物主要有阿米卡星（21/23，91.3%）、头孢曲松（20/23，87.0%）、大观霉素（20/23，86.9%）；此外产生高水平耐药性的药物主要有林可霉素、青霉素和阿莫西林，耐药率分别为 87.0%（20/23）、82.6%（19/23）、69.6%（16/23）。药敏试验结果见表1、表2。

表1 大肠杆菌分离株药敏试验的抑菌圈直径 mm

表2 大肠杆菌分离株的药敏试验结果

3 讨论与小结

本试验分离的大肠杆菌菌株来源于某市7家规模猪场中的发病腹泻仔猪的直肠内容物。分离出的24株疑似大肠杆菌中23株为大肠埃希氏菌，鉴定血清型多达7种，其中O157、O113为主要流行血清型。本试验的药物敏感性试验检测耐药性[5-6]结果显示，分离得到的大肠杆菌的耐药性已明显显现，其中抑菌效果较好的主要有阿米卡星、头孢曲松和大观霉素；产生耐药性的药物主要有林可霉素、青霉素和阿莫西林，同时结果显示同时对3种及以上的抗菌药物存在耐药性的分离菌株数量高达87.0%（20/23）。此项研究表明，该区域腹泻仔猪致病大肠杆菌主要以O157、O113为优势血清型，普遍存在抗药性，且耐药种类多样，抗药水平较高。这种现象的产生与猪场惯用抗菌方法有很大关系。因此为了更好地了解猪场细菌性疾病发展情况以及耐药情况，应定期收集病料进行流行病学调查和耐药性分析[7]，结合抗菌药物应用原则合理用药[8]，做到抗菌效果的优化，避免耐药菌株的产生。

此外仔猪大肠杆菌病发病与气候、温度、饲养管理方式以及饲养环境有相当大的关联性，例如圈舍潮湿阴冷、饲养管理模式不合理、饲养环境卫生不达标都会导致大肠杆菌病的发生。因此做好圈舍管理、饲养管理、环境控制是防控本病的重要手段[9]。