5型副猪嗜血杆菌河南分离株的毒力基因研究

张青娴，徐引弟，王治方，朱文豪，焦文强，李海利

（1.河南省农业科学院畜牧兽医研究所，河南 郑州 450002；2.河南省畜禽繁育与营养调控重点实验室，河南 郑州 450002）

副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,HPS）是猪多发性浆膜炎和关节炎（格拉瑟病）的病原体，常定植在猪的上呼吸道，在环境应激和感染免疫抑制性疾病时副猪嗜血杆菌进入血液暴发本病，引发全身性细菌感染[1]。

副猪嗜血杆菌至少分为15种血清型，我国流行的血清型为1、4、5和13，河南省以4型和5型居多[2-6]。目前常用的疫苗为全细菌灭活苗，但只对血清型1、4、5和6有保护力。血清型之间的交叉保护不一致，也缺乏区分感染猪和疫苗猪的可用方法，当疫苗株与临床分离株血清型不一致时，疫苗无法提供足够的免疫保护[7-9]。到目前为止尚未发现毒力和血清型之间的绝对关系，不同血清型的副猪嗜血杆菌分离株可携带不同的毒力基因[10-12]。检测田间分离株的毒力基因，探究其与血清型的相关性，有助于预测副猪嗜血杆菌分离株的致病力，而确定菌株的致病潜力对诊断和疾病控制很重要。

本试验对豫北某猪场疑似副猪嗜血杆菌病进行分离鉴定、血清型分型、毒力基因扩增和致病性试验，旨在探究副猪嗜血杆菌毒力因子的功能及其与血清型的相关性，为进一步认识其致病机理及研发新型亚单位疫苗和诊断试剂提供重要依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料 病料来源于豫北某猪场的疑似病猪，包括肺脏、心血、肝脏、脾脏、肾脏、脑脊液、关节液等，于2019年10月至2020年1月在河南省农业科学院畜牧兽医研究所传染病研究室进行分离鉴定及后续工作。

1.1.2 主要试剂 胰蛋白胨大豆琼脂培养基（tryptic soy agar,TSA）、胰蛋白胨大豆肉汤培养基（tryptic soybroth,TSB）为美国BD公司产品；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide,NAD）为Sigma公司产品；革兰氏染色液为珠海贝索生物技术有限公司产品；新生牛血清为郑州益康生物工程有限公司产品；PCR分子生物学试剂为宝生物（大连）工程有限公司产品。DMSO、甘油和甲氧氟醚等普通化学试剂购自北京陆桥技术股份有限公司。

1.1.3 试验动物 体重250～300 g的雄性豚鼠，购于郑州大学第一附属医院实验动物中心。

1.1.4 引物 参考Angen等[13]的方法，根据HPS M75065株16S rRNA的保守区基因设计特异性鉴定引物HPS F1/F2/R，扩增片段长度为1 090 bp。

F1：5'-TATCGRGAGATGAAAGAC-3'，F2：5'-GT AATGTCTAAGGACTAG-3'，R：5'-CCTCGCGGCTTCG TC-3'。

参考Howell等[14]的方法，合成用于鉴定HPS血清型的引物（表1）；参考乐敏等[15-17]的方法，合成鉴定HPS毒力因子的引物（表2）。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 血清型分型引物序列

表2 毒力基因引物序列

1.2 方法

1.2.1 细菌的分离培养 无菌采集病死猪的肺脏、心血、肝脏、脾脏、肾脏、脑脊液、关节液等病料，于生物安全柜内接种于TSA平皿（含5%新生牛血清和10 μg/mL NAD）上，37 ℃恒温培养 36～48 h。接种环挑取纯培养的细菌重悬于30 μL超纯水中，加入蛋白酶K 56℃裂解1 h。将混合物煮沸30 min，冰上冷却，于12 000 r/min离心3 min后收集上清液。使用动物全基因组DNA提取试剂盒提取1657株DNA。

16S rRNA PCR 反应体系（总体积 25 μL）包括12.5 μL 2×Taq PCR master mix，上游引物（50 μmol/L）下游引物（50 μmol/L）1 μL，8.5 μL 超纯水和 2 μL DNA模板（浓度>10 ng/μL）。反应条件如下：94℃初始变性3 min；35个循环，94 ℃ 1 min，56 ℃ 45 s，72 ℃1 min，最终72℃延伸5 min。使用1%琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物。

将16S rRNA扩增阳性产物测序，鉴定所有可疑的副猪嗜血杆菌菌落。无菌条件下接种环挑取PCR鉴定阳性的菌落置于2 mL TSB肉汤（含5%新生牛血清和 10 μg/mL NAD）中，37 ℃培养 18～24 h，添加30%甘油分装保存在-80℃备用。

1.2.2 血清分型 配置反应体系如下：25 μL体系，12.5 μL 2×Taq PCR master mix，1.5 μL 上游引物（50 μmol/L），1.5 μL 下游引物（50 μmol/L），2 μL DNA模板（浓度>10 ng/μL），0.25 μL 的 DMSO 和 7.25 μL的超纯水进行PCR：94℃初始变性2 min；35个循环，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，最终 72 ℃延伸5 min。使用2%琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物。

1.2.3 毒力基因鉴定 已知的毒力基因、引物和每种扩增产物的大小如表2所示。PCR反应体系（总体积 25 μL）包括 12.5 μL 2×Taq PCR master mix，2 μL每条引物（50 μmol/L），7.5 μL 超纯水和 1 μL DNA（浓度>10 ng/μL）。94℃初始变性2 min；35个循环，94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，最终72℃延伸5 min。使用2%琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物。

1.2.4 致病力试验 经预试验，副猪嗜血杆菌1657株腹腔感染的半数致死量为1.8×109CFU。故将腹腔感染试验分组和菌量安排如下：分为3个试验组和1个空白对照组，每组5只豚鼠，试验组每只豚鼠接种的剂量为 1 mL，菌量分别为 4.0×109CFU、2.0×109CFU和4.0×108CFU。空白对照组接种1 mL生理盐水。试验结束时，存活的小鼠用过量的甲氧氟醚杀死。

2 结果

2.1 HPS 1657株的分离鉴定

肺组织经48 h培养后，在TSA平皿上长出直径约0.2 mm、光滑圆润、无色透明的针尖状小菌落，革兰氏染色为多个不同形状的菌体，呈短杆状、杆状或长丝状。将该菌株命名为1657株。其他组织未分离出可疑致病菌。

经16S rRNA PCR鉴定后，1%琼脂糖凝胶电泳可见大小为1 090 bp的目的片段（图1）。测序结果经NCBI网站BLAST序列对比后与HPS吻合率99.8%以上，故1657株为HPS。

2.2 HPS 1657株的血清型鉴定

用PCR方法扩增15种血清型，经2%琼脂糖凝胶电泳后，在450 bp处出现一条明亮的目的条带（图2），将扩增产物测序，经NCBI网站BLAST序列对比后与5型HPS吻合率99.8%以上，故1657株为5型HPS。

2.3 HPS 1657株的毒力基因测定

以分离株的DNA为模板，用PCR方法扩增上述14种毒力基因，2%琼脂糖凝胶电泳分析，得到全部为阳性的目的条带（图3）。

2.4 HPS 1657株的致病性试验

腹腔注射试验结果显示，豚鼠感染后4 h内即出现食欲废绝、呼吸困难、精神沉郁和共济失调等症状，6 h后出现死亡。最终7 d内高剂量组豚鼠死亡4只，中间剂量组有2只死亡，而最低剂量组和空白对照组无死亡豚鼠。剖检死亡豚鼠后可见典型的败血症、纤维素性多发性浆膜炎、胸腹腔积液、关节炎和脑膜炎等症状，中间剂量组未出现浆膜炎症状，未死亡豚鼠无明显症状。无菌取死亡豚鼠的肺脏、肾脏、脾脏、肝脏、心血、关节液和脑脊液等主要器官，接种含NAD和新生小牛血清的TSA培养基，能再次分离到该种病原菌，未死亡的豚鼠未分离出该菌。上述试验表明1657株在菌液浓度为2.0×109CFU/mL即可达到半数致死量，说明1657株毒力较强。

3 小结

本次分离的副猪嗜血杆菌1657株为肺分离株，血清型为 5型，14种毒力基因（lsgB、capD、vta1、vta2、vta3、wza、hhdA、hhdB、ompP2、nanH、cdtA、cdtB、cdtC、espP2）均为阳性，且致病性试验显示为强毒株。

4 讨论

菌株的血清型通常被视为菌株毒力强弱的标志，血清型与毒力之间存在一定的相关性，也有研究发现这种关系并不确定[18]。部分血清型相同但不同分离地区的菌株在毒力试验时表现出差异性，约有15%～41%毒力较强的菌株无法确定血清型，使HPS流行病学研究遇到一定阻力[19]。

目前对副猪嗜血杆菌致病性的研究主要集中于毒力因子，但毒力因子的数量与功能尚未完全探究清楚。唾液酸转移酶编码基因lsgB基因主要存在于组织部位分离的副猪嗜血杆菌中，而从鼻腔分离的菌株中均未检测到，且lsgB只存在于毒性菌株中[20]。副猪嗜血杆菌具有神经氨酸酶基因nanH和神经氨酸酶活性。神经氨酸酶基因nanH能够清除宿主的唾液酸，唾液酸可作为碳源和/或氮源通过唾液酸转移酶lsgB被整合入脂寡糖[21]。假定荚膜产生基因capd基因编码一种多糖生物合成蛋白，该蛋白与副猪嗜血杆菌的毒性有关[22]。wza基因在毒力因子荚膜多糖转运过程起重要作用，缺失wza基因能使HPS毒力显著降低[23]。vta3在毒力菌株和无毒力菌株中均高度保守，而vta1和vta2主要在致病菌株中为阳性[24]。体内感染条件下，细胞致死膨胀毒素操纵子（cytolethal distending toxin,cdt）和溶血毒素操纵子hhd均出现上调表达，表明该类毒素基因是副猪嗜血杆菌直接发挥细胞毒性作用的重要武器[15]。Mcvicker等发现副猪嗜血杆菌与流感嗜血杆菌具有同源性的外膜蛋白ompP2和ompP5，该蛋白与细菌黏附有关，在毒力株和非毒力株中蛋白的分子质量大小有所不同[25]。血清 2、4、5、10、12、13、14、15 型HPS株的ompP2基因在450～524 bp和770～844 bp范围内，存在共计100 bp左右的碱基缺失，而血清1、3、6、7、8、9、11 型参考菌株 ompP2 基因不存在缺失，并且这些发生碱基连续缺失的参考血清型菌株均为公认的毒力菌株[26]。胞外丝氨酸蛋白酶（extracellular serine protease,ESP）在感染猪的过程中发生表达，esp P2蛋白与流感嗜血杆菌编码IgA蛋白酶的基因具有同源性，豚鼠用重组esp P2蛋白免疫后，对HPS的攻毒产生了部分保护[27]。Chao等通过研究越南中部副猪嗜血杆菌分离株的血清型和毒力基因的表 征 发 现 ，lsgB、capD、wza、hpm-1372、hpm-1373、vta2和vta3等大多数毒力基因分布在高度和中度毒力血清型组，5/12型血清型与capD有一定相关性[28]。乐敏首次绘制出副猪嗜血杆菌SH0165株基因组的潜在毒力因子图，筛选出部分主要的毒力相关基因或操纵子基因（nanH、oapA、ompP5、pilA、ompP2、cdtABC、hhdAB、prtC、sodAC、sphB、espP、fkpA、mip、mviN和HAPS-0694），发现所筛选出的基因在我国HPS流行菌株中高度保守，推测这些毒力基因很有可能是HPS致病关键因子[15]。HPS毒力因子的界定将大大提高毒力和非毒力菌株的鉴别，需要更多的研究来验证副猪嗜血杆菌各毒力蛋白的具体作用[29]。

综上所述，本研究分离的副猪嗜血杆菌1657株为血清型5型菌株，且含有多种毒力基因，其强致病性可能由于多个毒力基因的协同作用，是否上述毒力因子是决定HPS致病力的基因还有待于进一步的基因敲除与回归试验验证[30]；是否被界定为强毒株的血清型中均含有上述毒力基因有待进一步扩大田间分离株范围。

Morozumi等选择小鼠作为HPS试验模型，基本不发病或者死亡很少，且病变很少[31]。但由于小鼠操作上的优越性，可作为筛选HPS毒力蛋白的模型[23，32]。本试验采用豚鼠做为试验动物模型，很大程度上还原了副猪嗜血杆菌病的流行病经过，相比SPF猪代价低，周期短，可以作为HPS试验动物首选。

本文提供了豫北某发病猪场副猪嗜血杆菌血清型和毒力基因的第一手资料，研究了该分离株血清型与毒力基因的相关性，对了解该地区的副猪嗜血杆菌流行病学特征和防控该病具有重要意义。