狂犬病病毒抗原的浓缩及纯化工艺的研究

张 宁 龚本义 刘冬禹 杨丹丹 殷玉和 吴丛梅

（长春工业大学 化学与生命科学学院，吉林长春 130012）

狂犬病是由狂犬病病毒引起的一种传染病，一旦发病100%死亡[1]。狂犬病病毒属于弹状病毒科，是一种广泛传播的人畜共患疾病[2]。目前，狂犬病除了临床和实验室评估外，狂犬病的预防和控制还取决于快速、具体的诊断技术[3]。本试验根据需要设计了3种不同浓缩纯化方法，建立了PEG沉淀浓缩及蔗糖密度梯度离心纯化、Zn（AC）2沉淀浓缩及蔗糖密度梯度离心纯化、Zn（AC）2沉淀浓缩及Sepharose 4 Fast Flow分离纯化制备狂犬病病毒抗原，为狂犬病抗体荧光微球检测试纸奠定了基础。

1 材料

1.1 抗原、血清及细胞

狂犬病病毒CVS-11株病毒液由北京大北农科技集团股份有限公司提供；

狂犬病阳性血清由军事医学科学院军事兽医研究所惠赠；

阴性血清由长春西诺生物科技有限公司提供；

BHK-21细胞引自中国兽医药品监察所。

1.2 试剂

PEG 6000、Zn（AC）2、蔗糖等购自北京化工厂以及Ameresco公司；Sepharose 4 Fast Flow 凝胶购自GE Healthcare公司；辣根过氧化物酶标记的兔抗犬IgG 购自上海远慕生物科技有限公司。

2 方法

2.1 狂犬病灭活病毒液制备

狂犬病病毒CVS-11株病毒液，灭活后制成病毒液[4]，检验合格后，-20℃以下保存备用。

2.2 抗原浓缩纯化工艺的研究

将病毒液，4℃、3000r/min离心30min，取上清备用。

2.2.1 PEG沉淀浓缩及蔗糖密度梯度离心纯化 上清液加入NaCl使终浓度为0.5mol/L，加等量10% PEG 6000，4℃过夜，8000r/min离心30min，沉淀加入PBS后为浓缩病毒。取浓缩液以蔗糖密度梯度离心进行纯化（梯度依次为20%、30%、40%、55%），可见40～55%间有白色条带，用试剂盒进行检测确定此条带为纯化狂犬病病毒。

2.2.2 Zn（AC）2沉淀浓缩及蔗糖密度梯度离心纯化 上清液加入Zn（AC）2，静置30min，10000r/min 4℃离心30min，沉淀以饱和EDTA 悬浮，4℃溶解至溶液透明，3000r/min 4℃离心30min，上清即为病毒浓缩液。取其以蔗糖密度梯度离心进行纯化，可见40～55%间有白色条带，用试剂盒进行检测确定此条带为纯化狂犬病病毒。

2.2.3 Zn（AC）2沉淀浓缩及Sepharose 4 Fast Flow纯化上清液加入Zn（AC）2，静置30min，10000r/min 4℃离心30min，沉淀以饱和EDTA悬浮，4℃溶解至溶液透明，3000r/min 4℃离心30min，上清即为病毒浓缩液。用 Sepharose 4 Fast Flow对浓缩病毒液进行纯化[4]。

2.3 纯化病毒检验

（1）蛋白浓度检验 BCA法测定蛋白含量。

（2）蛋白纯度检验 进行SDS-PAGE，分析蛋白纯度。

（3）Western-blotting。

（4）活性检验。

3 结果

3.1 浓缩纯化抗原浓度和纯度检验

纯化抗原总量和纯度PEG沉淀浓缩及蔗糖密度梯度离心纯化法均低于后两种方法，Zn（AC）2沉淀浓缩后蔗糖密度梯度离心纯化抗原与Sepharose 4 Fast Flow纯化后收获蛋白总量和纯度见表1，纯化SDS-PAGE和Western-blotting 见图1、图2。

表1 3种方法纯化抗原检测结果

图1 Zn（AC）2沉淀浓缩及蔗糖密度梯度离心纯化抗原SDS-PAGE图谱

图2 Zn（AC）2沉淀浓缩及蔗糖密度梯度离心纯化抗原Westernblotting图谱

3.2 浓缩纯化抗原活性检测

PEG沉淀浓缩及蔗糖密度梯度离心纯化抗原制备的检测试纸条荧光强度弱于后两种方法，Zn（AC）2沉淀浓缩及蔗糖密度梯度离心纯化抗原与Zn（AC）2沉淀浓缩及Sepharose 4 Fast Flow纯化抗原制备的检测试纸条荧光强度无明显差异，见表2。

表2 不同病毒抗原制备试纸条荧光强度

4 结论

通过上述3种纯化方法制备狂犬病病毒抗原蛋白进行病毒含量、纯度及与活性检验，考虑成本及工艺，选择Zn（AC）2沉淀法浓缩及蔗糖密度梯度离心纯化法制备狂犬病病毒抗原。此方法制备的狂犬病病毒纯化抗原用荧光微球标记后可有效结合兔抗狂犬病病毒IgG。