固相萃取—高效液相色谱—串联质谱法测定动物源食品中万古霉素类抗生素残留量

林 津 范小龙 江 丰彭青枝 周陶鸿

(1. 湖北省食品质量安全监督检验研究院，湖北 武汉 430075；2. 湖北省食品质量安全检测工程技术研究中心，湖北 武汉 430075)

万古霉素类抗生素是由链霉菌产生的一类具有复杂结构的糖肽类抗生素，其中典型的代表物有万古霉素和去甲万古霉素[1]。该类抗生素通过抑制肽聚糖的生物合成，可对革兰氏阳性菌起到强力的灭杀作用，由于其药效显著，常常使用于其他抗生素对病菌无效时，即所谓的临床“最后一线”抗生素[2]。虽然中国农业农村部公布的食品动物禁用的兽药及其他化合物清单中万古霉素赫然在列，但由于兽药生产经营秩序不够规范，兽药滥用现象仍然较为严重，不法企业或养殖户可能将其用于动物养殖，减少动物疫病的发生，以扩大养殖利润[3-4]。可靠的残留检测方法是进行农产品抽检和市场监管的基础和前提。因此，建立动物源食品中万古霉素类抗生素残留量检测方法，加强相关食品的监控是非常必要的。

目前现行有效的针对万古霉素类抗生素的检测方法标准只有农业部1862号公告-3-2012《饲料中万古霉素的测定 液相色谱—串联质谱法》和吉林地方标准DB22/T 1825—2013《猪肉中万古霉素残留量的测定 液相色谱—质谱/质谱法》，标准适用性较窄，难以广泛应用，不利于中国动物性食品安全监管。而关于万古霉素类化合物的分析方法已见报道的有：液相色谱法、液相色谱—串联质谱法、酶放大免疫法、毛细管电泳化学发光法、荧光偏振免疫法、近红外光谱法、微生物法[5-7]等，分析对象主要是集中在人体样本如血清、血浆和尿液[8-10]等。而针对动物源食品的分析研究并不多，且基质较单一，基本只有单独检测猪肉、牛乳和鱼虾等一种基质，且目标物主要集中在万古霉素这一种物质上，导致此类抗生素检测覆盖不全，不利于检测资源的优化配置和监管效能的提高[1-5]。所以对于脂肪含量较高、基质成分复杂的动物源食品中万古霉素类抗生素同时测定的研究还较少，且提供的方法在实际操作过程中相对复杂、稳定性差[6-7]。研究拟采用固相萃取净化—高效液相—串联质谱联用的分析方法，对日常食用的动物源性食品基质中万古霉素类抗生素的残留进行检测，以期为兽药残留监管提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪肉、鸡肉、鸭肉、猪肝：武汉市售；

万古霉素和去甲万古霉素标准品：纯度均>98%；美国MCE公司；

双去氯万古霉素标准品：纯度>75%；加拿大Toronto公司；

乙腈、甲酸、甲醇：色谱纯，德国Merck公司；

氨水、盐酸、正己烷：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

OasisMCX固相萃取柱：美国Waters公司；

试验用水：一级水，美国Mill-pore-Q超纯水仪制得。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪：Ultimate 3000型，美国Thermo公司；

串联四极杆质谱仪：AB sciex 4500型，美国Applied Biosystems公司；

电子天平：ME2002E型和XS204型，瑞士Mettler-Toledo公司；

超声清洗器：Elmasonic P60H型，德国Elma公司；

台式冷冻离心机：Allegra X-15R型，美国Beckman公司；

水浴氮吹仪：N-EVAP24型，美国Organomation公司；

数显漩涡混合器：EOFO-9456型，美国Taloys公司。

风电机组的联轴器是整机中故障率比较高的部件，而且联轴器发生失效后，对机组的安全、稳定运行有很大的影响。失效型式和预防措施，可为其他风电机组联轴器的设计、测试验证及降低失效率提供了参考。

1.3 标准溶液配制

准确称取25 mg万古霉素标准品和去甲万古霉素标准品，于不同的25 mL容量瓶中，用甲醇充分溶解，再定容至刻度线，摇匀，配制成1 mg/mL的标准储备液。准确称取双去氯万古霉素标准品10 mg(精确至0.000 1 g)，于10 mL容量瓶中，用甲醇充分溶解，再定容至刻度线，摇匀，配制成1 mg/mL的内标储备液。以上储备液均置于4 ℃保存，有效期1个月。

用0.1%甲酸水溶液稀释，配制成浓度为1 μg/mL的万古霉素和去甲万古霉素混合标准中间液以及1 μg/mL的双去氯万古霉素内标中间液，4 ℃条件下可保存1个月。临用前，分别准确移取适量的1 μg/mL的万古霉素和去甲万古霉素混合标准中间液以及双去氯万古霉素内标中间液，用0.1%甲酸水溶液进行稀释，制成内标浓度为100 μg/L的标准系列工作溶液(20～200 μg/L)。

1.4 样品预处理

1.4.1 样品提取 称取5.00 g经组织捣碎机绞碎并充分均质后的样品于50 mL离心管中，加入100 μL浓度为1 μg/mL 的双去氯万古霉素内标中间液，加入10 mL 0.1% 甲酸—乙腈提取液(体积比70∶30)，加盖涡旋混匀1 min，并超声提取15 min。然后在4 ℃、9 500 r/min离心10 min，将上清转移至50 mL离心管中。残渣用10 mL 上述提取液重复提取一次，合并两次上清，加入5 mL 乙腈饱和正己烷，涡旋混匀1 min，4 ℃、9 500 r/min 离心10 min，取下层清液，待净化。

1.4.2 样品净化 Oasis MCX固相萃取柱使用前依次用3 mL甲醇、3 mL水、3 mL 0.1 mol/L盐酸溶液活化，保持柱体湿润。取全部待净化液加入活化后的固相萃取柱，上样后依次用3 mL 0.1 mol/L盐酸溶液，3 mL甲醇淋洗，弃去全部淋洗液。最后用6 mL流速稳定1 mL/min 内的5%氨水—甲醇溶液洗脱，并收集洗脱液，置于40 ℃水浴氮气吹干，用1 mL 0.1%甲酸水溶液—乙腈溶液(体积比90∶10)复溶，过微孔滤膜(0.22 μm)后，上HPLC-MS/MS测定。

1.5 色谱条件

色谱柱选用Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱，规格型号为2.1 mm×100 mm，2.2 μm；流速0.3 mL/min；柱温35 ℃；进样量5 μL；HPLC梯度洗脱条件见表1。

表1 HPLC梯度洗脱程序

1.6 质谱条件

离子源类型：ESI源；扫描方式：MRM正离子模式扫描；离子源温度(TEM)：550 ℃；雾化气(Gas1)：34 MPa；辅助气(Gas2)：38 MPa；气帘气(Gurtain Gas)：25 MPa；电喷雾电压：4 500 V；通过仪器优化后的万古霉素、去甲万古霉素及双去氯万古霉素的质谱参数见表2。

表2 目标物和内标的质谱参数†

2 结果与分析

2.1 质谱条件的确立

万古霉素、去甲万古霉素和双去氯万古霉素的电喷雾离子化效果较好，故采用电喷雾离子化源进行分析。根据物质化学性质和结构，通常选择丰度最高的离子对为母离子[11]，同时在正负模式下对比母离子响应强度，最终选择在正离子模式下进行分析。将高浓度的目标物和内标溶液在正离子模式下通过一级扫描找到母离子，对选定的母离子加优化好的碰撞能击碎，同时进行二级扫描找到对应的碎片离子[12]。万古霉素类抗生素是由多个氨基酸和糖缩合而成的糖肽类大分子化合物，进入质谱后很容易与H+结合，产生双电荷或三电荷离子[13]。经试验目标物和内标均选择丰度最大的双电荷m/z725.4，718.4，690.9作为母离子，定性离子取干扰较小、丰度较高的两个质荷比分别为144.1和100.1碎片离子[14]，且丰度最高m/z144.1作为定量离子。在选择好的特征碎片离子的基础上，对产生碎片离子的碰撞能量、锥孔电压等其他质谱参数进一步优化来提高分析方法的灵敏度，进一步优化后最终确立的质谱重要参数及相应的质谱条件见1.6。

2.2 色谱条件的确立

2.3 前处理方法的优化

2.3.1 提取试剂的选择 在阴性猪肉基质中添加了100 μg/kg 目标物，考察了0.1%甲酸溶液和0.1%甲酸—乙腈体积比分别为90∶10，80∶20，70∶30，60∶40的溶液提取效果。单纯用0.1%甲酸溶液提取动物源样品时，由于基质中的蛋白没有得到有效沉淀，提取液较浑浊，必须提高乙腈比例沉淀蛋白。随着乙腈相比例的提高，提取液逐渐澄清，但乙腈相比例超过30%时回收率无法进一步提升，且基质效应明显，结果如图2所示，最终选择0.1%甲酸—乙腈(体积比70∶30)溶液作为提取液。

2.3.2 净化条件的优化 动物源食品中难免有较多的脂类杂质，经0.1%甲酸—乙腈(体积比70∶30)溶液提取后，仍不足以去除脂类杂质的干扰，于是增加了正己烷除脂步骤。由于目标物微溶于乙腈，而乙腈与正己烷还存在少量互溶，若要避免万古霉素类抗生素在萃取时的损失，使用乙腈饱和的正己烷除脂效果更好[17]。加入5 mL的乙腈饱和正己烷，涡旋混匀1 min，可以看到正己烷层明显有油脂析出，说明除脂效好。

图1 添加目标物样本的选择离子流色谱图Figure 1 Selected ion chromatogram of samples for adding objects

图2 不同配比的0.1%甲酸水溶液—乙腈提取液效果比较Figure 2 Extraction efficiency with different solutions

试验检测对象为动物源样品，基质较复杂，若直接提取后上机，不进行进一步的净化处理，提取液中一并提取的其他杂质必定会对检测带来干扰和影响，从而影响最终结果的准确性，因此必需要增加净化处理步骤[18]。由于含有碱性的伯氨基团，目标物偏弱碱性[5]，将市面上主流厂家的固相萃取柱，如Waters、Agela、Thermo、Agilent的阳离子交换柱MCX柱、C18柱和HLB柱等进行对比。配制浓度为60 μg/L的目标物混合标液，采用标准溶液直接过固相萃取柱净化的方式考察不同固相萃取柱的影响。结果表明，阳离子交换柱(3 mL)净化，目标物回收率为90%～95%；HLB柱(3 mL)净化，万古霉素和去甲万古霉素的回收率为50%～70%；用C18柱(3 mL)净化时，万古霉素和去甲万古霉素的回收率为30%～40%。基于回收率的对比情况，故用阳离子交换柱MCX柱来净化万古霉素、去甲万古霉素。

2.4 基质效应的消除

基质效应(ME)是影响定量分析结果准确性的重要因素，是通过阴性基质匹配标线与纯溶剂配制标曲二者的斜率之比来进行评价的[11]。分别配制浓度范围为20～200 μg/L的阴性基质匹配的标准溶液和纯溶剂标准溶液，计算两者斜率比值。针对动物源食品基质，万古霉素和去甲万古霉素的ME均在70%左右，说明存在一定程度的离子抑制效应。为消除基质效应使定量更加精准，既可采取基质匹配外标曲线校正法，也能采用内标法定量。选择内标物时，不仅要求内标物与目标物的物理化学性质相似，同时不与被测定样品发生化学反应，且应与目标物的出峰时间相近等[19]。试验选用的内标物——双去氯万古霉素的结构只比万古霉素分子结构的少2个氯，所以其结构和性质与万古霉素基本无差异，可以满足内标物的要求[20]。目前使用该内标物进行万古霉素和去甲万古霉素检测的研究较少，主要分布在鱼虾基质中。

2.5 线性范围、检出限(LOD)与定量限(LOQ)

配制浓度依次为20，40，80，120，160，200 μg/L的混合系列标准工作溶液，在上述优化后的液相条件、质谱参数及最终确立的分析方法下进行测定。以目标物的浓度(μg/L)为x，万古霉素或去甲万古霉素与内标双去氯万古霉素的峰面积比值为y，进行线性曲线拟合。如表2所示，在20～200 μg/L的线性范围内，目标物线性关系良好，相关系数R2均可达到0.997以上。将阴性基质加标样按优化后的前处理方法进行处理，同时按最终确立的分析方法进行检测，以目标物信号噪声比值(S/N)为3时的加标水平作为LOD，以S/N为10时的加标水平作为LOQ，方法检出限可低至1.0 μg/kg，定量限可达到3.0 μg/kg。

表3 目标物的线性范围、回归方程、相关系数、检出限和定量限

2.6 方法的回收率与精密度

分别取猪肉、鸡肉、鸭肉、猪肝4种基质，基质中均不含试验方法所检测的目标物，按照20，50，200 μg/kg 3个浓度水平分别添加标样，每个水平做6个平行样，按上述方法进行分析，计算回收率和精密度，具体数据见表4。

表4 试验方法的回收率与精密度

结果表明，目标物的平均加标回收率为88.7%～115.1%，相对标准偏差(RSD)为3.1%～9.4%(n=6)。按照GB/T 27404—2008标准，在被测组分含量小于0.1 mg/kg时回收率的要求为60%～120%，被测组分含量在0.1～1.0 mg/kg 时回收率的要求为80%～110%。因此，试验方法回收率和精密度均满足要求。

3 结论

试验建立了一种动物源食品中万古霉素类抗生素残留量的高效液相色谱—串联质谱检测分析方法，通过选择提取效率更高的提取液，除脂效果更好的萃取液，阳离子固相萃取柱净化的一系列前处理步骤更进一步的减少了杂质干扰，且对比考察了更优的色谱及质谱条件，同时使用双去氯万古霉素作为内标物进行定量分析，有效提高了检测的灵敏度和准确度，并进一步降低了检出限。在20～200 μg/kg添加水平范围内的平均回收率为88.7%～115.1%，相对标准偏差为3.1%～9.4%(n=6)，方法检出限低至1.0 μg/kg，定量限达到3.0 μg/kg。该方法回收率高，检出限低，分析时间短，适用于批量的动物源食品中万古霉素类抗生素残留量的同时检测。试验建立的方法在已报道的猪肉制品、水产品等基质基础上又有了进一步的扩充和验证，同时又由于合适的内标的引入比基质匹配的方法在基质消除这一方面更简便快捷，使得试验方法基质覆盖更全、适用性更广、实用性更强。以复杂基质样品为分析对象时，固相萃取—高效液相色谱—串联质谱的分析方法的高分离性、高选择性、高灵敏度以及能获取目标物结构信息[7]等一系列优点，能够满足痕量分析检测的要求，将在动物源食品抗生素残留量抽检工作方面发挥越来越重要的作用。