siRNA干扰CPEB4基因表达对胶质瘤侵袭与生长的影响

梁 博 王新军△ 袁 丁 周少龙 寿记新 付旭东 杨 卓

1)郑州大学第五附属医院，河南 郑州 450052 2)郑州大学第一附属医院，河南 郑州 450052

脑胶质瘤是最常见的原发性神经系统肿瘤，儿童和成人脑胶质瘤患者临床预后较差[1]。尽管很多先进的诊断技术和综合治疗已经用于脑胶质瘤的诊治，但脑胶质瘤的发病率和病死率仍然很高[2]。深入了解神经胶质瘤发生发展过程中的生物学和分子机制可能成为治疗脑胶质瘤的重要途径[3]。胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4(cytoplasmic polyadenylation element-binding proteins 4，CPEB4)是一组高度保守的具有特殊序列的介导mRNA胞质多聚腺苷酸化和翻译的RNA结合蛋白[4]，研究发现CPEB4在肿瘤的发生发展中发挥重要作用[5-6]。本研究利用RNA干扰技术，从分子水平研究胶质瘤的发生及浸润转移机制，为靶向治疗胶质瘤提供了理论基础和实验依据。

1 材料与方法

1．1材料选择2013-03-2015-04郑州大学第五附属医院手术切除的62 例人脑胶质瘤标本，其中男35例，女27例，年龄13～77(46.2±13.1)岁，按照WHO 2007胶质瘤分级标准分为Ⅰ级4例，Ⅱ级14例，Ⅲ级20例，Ⅳ级24例。肿瘤标本均经神经病理医师确诊。另选取同期8例脑出血或脑外伤进行减压手术的无神经系统肿瘤的正常脑组织，其中男5例，女3例，年龄12～75(47.4±18.4)岁。

1．2免疫组织化学染色采用免疫组化染色检测2组脑组织中CPEB4蛋白的表达，组织脱水后石蜡包埋，组织切片脱蜡复水，修复抗原，血清封闭，加入CPEB4抗体，4 ℃过夜，PBS液代替一抗作阴性对照，DAB液显色，苏木素复染，二甲苯透明，封片，显微镜下拍照。按照阳性细胞百分比和阳性细胞染色强度之和进行统计，阳性细胞百分比<10%为0分，10%～25%为1分，26%～50%为2分，>51%为3分；染色强度按肿瘤细胞深浅标记，不着色为0分，染色较弱为1分，染色中等为2分，染色较强为3分，将两种得分进行相加，0分为阴性(-)，1～2分为弱阳性(+)，3～4分为中等阳性(++)，5～6分为强阳性(+++)。

1．3蛋白质免疫印迹Westernblot将组织加入RIPA蛋白裂解液中，提取蛋白并测定含量，在预先制好的12%聚丙烯酰胺凝胶板的每个孔内加入蛋白样本，电泳后转膜。5%脱脂牛奶封闭，加入CPEB4、GAPDH抗体，4 ℃过夜。次日TBST清洗3次后加入相应二抗，室温孵育1 h后TBST清洗3次，化学发光试剂(ECL)进行条带显影。

1．4实时荧光定量PCR(Real-TimePCR)RNAiso Plus试剂(TaKaRa)提取总RNA并测定RNA浓度，反转录呈cDNA，Real-Time-PCR进行扩增。CPEB4的引物序列：上游引物：5’-TGGGGATCAGCCTCTTCATA-3’，下游引物：5’-CAATCCGCCTACAA ACACCT-3’，GAPDH的引物序列：上游引物：5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’，下游引物：5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。计算2-ΔΔCt，比较各组目的基因的相对表达水平。

1．5CPEB4RNA干扰慢病毒载体的制备人胶质细胞瘤细胞株U251和U87及人胰腺癌细胞株PANC-1购自上海生物细胞研究所。利用软件设计合成3对特异性的siRNA序列。将对照序列和3组siRNA转染到U87细胞系48 h后，利用Western blot与Real-Time PCR筛选干扰效果最佳的siRNA，并制备慢病毒载体携带的介导的CPEB4-siRNA，慢病毒转染U87构建CPEB4下调的稳转U87细胞株。

1．6胶质瘤细胞系U87的克隆形成及侵袭性试验将U87分为空白对照组、对照siRNA转染组和siRNA-3转染组，处理后继续培养10 d，PBS洗涤后给予苏木精溶液染色，显微镜下拍照，计数集落形成数。应用24孔Transwell小室进行体外侵袭试验，每孔上室内加入无血清稀释的U87细胞，下室内加入含10% FBS的DMEM培养基作为趋化因子，培养6 h后用棉签将上室内附着细胞擦去，4%甲醛固定，下室附着细胞用结晶紫染色，显微镜下拍照并计数。

1．7裸鼠成瘤试验20只SPF级的BALB/C雄性裸鼠(购自上海中科院动物中心)，随机分为3组，分别注射未干预的U87、对照siRNA处理的U87和CPEB4下调的U87，4周后观察肿瘤生长情况。

2 结果

2．1正常脑组织和不同级别胶质瘤中CPEB4的表达CPEB4主要表达于胶质瘤组织的细胞质，正常脑组织CPEB4的表达呈弱阳性；CPEB4的表达也随WHO分级的增加而增加(图1)；正常脑组织CPEB4的阳性率仅为12.5%，WHOⅠ胶质瘤阳性率为50.0%，WHO Ⅱ胶质瘤阳性率为64.3%，WHO Ⅲ胶质瘤阳性率为90.0%，WHO Ⅳ胶质瘤阳性率为100%，与对照组(1/8，12.5%)相比，脑胶质瘤组织CPEB4阳性率(53/62，85.5%)显著升高(χ2=4.153，P=0.042)。见表1。

2．2正常脑组织和不同级别胶质瘤中CPEB4蛋白和mRNA表达Western blot和Real-Time PCR结果显示，与正常脑组织相比，胶质瘤组织CPEB4蛋白和mRNA表达明显升高，随着WHO分级增加，CPEB4蛋白和mRNA水平也显著增加(图2、表2)，结果与免疫组化结果相符。

2．3不同胶质瘤细胞系CPEB4表达脑胶质瘤细胞系U251和U87中都有CPEB4的表达，但U87细胞系CPEB4的蛋白和mRNA水平显著高于U251细胞系(P<0.05，图3、表3)。

2．4不同CPEB4-siRNA的干扰效率检测利用Western blot和Real-Time PCR筛选出干扰效率最佳的siRNA序列，如图4和表4所示，病毒表达载体介导的CPEB4-siRNA序列3转染可显著降低U87的CPEB4蛋白和mRNA水平(P<0.05)。

表1 正常脑组织和不同级别胶质瘤中CPEB4的表达 (n)Table 1 Comparison of CPEB4 expression in normal brain tissue and glioma tissues (n)

图1 正常脑组织和不同级别胶质瘤中CPEB4的表达 A：正常脑组织(对照组)；B：WHO Ⅰ 胶质瘤；C：WHO Ⅱ胶质瘤；D：WHO Ⅲ胶质瘤；E：WHO Ⅳ胶质瘤

2．5干扰CPEB4对胶质瘤细胞系U87的克隆形成及侵袭性与空白组和对照siRNA组相比，干扰CPEB4表达可显著降低胶质瘤细胞系U87的集落形成数和侵袭细胞数(P<0.05，图5、表5)。

表2 正常脑组织和不同级别胶质瘤中CPEB4的蛋白和mRNA表达

表3 不同级别胶质瘤中CPEB4的表达

表4 不同CPEB4-siRNA 的干扰效率检测

图2 正常脑组织和不同级别胶质瘤中CPEB4的表达 A：1：正常脑组织(对照组)；2：WHO Ⅰ 胶质瘤；3：WHO Ⅱ 胶质瘤；4：WHO Ⅲ胶质瘤；5：WHO Ⅳ；B：CPEB4蛋白表达；C：CPEB4 mRNA表达。与正常脑组织相比，*P<0.05Figure 2 CPEB4 expression．A：1：normal brain tissue(The control group)；2：WHO Ⅰ；3：WHO Ⅱ；4：WHO Ⅲ；5：WHO Ⅳ；B：Protein expression of CPEB4；C：mRNA expression of CPEB4.*P<0.05 compared with normal brain tissue

图3 不同胶质瘤细胞系CPEB4的表达 A：1：PANC-1为阳性对照；2：U251；3：U87；B：CPEB4蛋白表达；C：CPEB4 mRNA表达。与胶质瘤细胞系U251相比，*P<0.05Figure 3 Expression of CPEB4 in different gliomascell line．A：1：PANC-1 was a positive control；2：U251；3：U87；B：Protein expression of CPEB4；C：mRNA expression of CPEB4．*P<0.05 compared with U251

表5 干扰CPEB4对胶质瘤细胞系U87的克隆形成及侵袭性

2．6在体干扰CPEB4对脑胶质瘤细胞生长的影响裸鼠皮下接种不同干预的U87细胞4周后，CPEB4的蛋白和mRNA水平显著抑制(P<0.05，图6、表6)，且下调CPEB4组的裸鼠形成肿瘤的体积和质量显著降低，抑瘤率达78.9%(P<0.05，图7、表7)。

表6 在体干扰CPEB4的效率检测Table 6 Comparison of CPEB4 protein and mRNA expressionin different xenograft mouse

图4 干扰效率检测 A：1：对照序列；2：siRNA-1序列；3：siRNA-2序列；4：siRNA-3序列；B：CPEB4蛋白表达；C：CPEB4 mRNA表达。与对照序列相比，*P<0.05Figure 4 Interference efficiency detection．A：1：control sequence；2：siRNA-1 sequence；3：siRNA-2 sequence；4：siRNA-3 sequence；B：Protein expression of CPEB4；C：mRNA expression of CPEB4.*P<0.05 compared with the control sequence

3 讨论

脑胶质瘤是中枢神经系统中最常见的肿瘤。针对胶质瘤的治疗，尽管采取了不同的方法进行积极的治疗，但胶质瘤以其高侵袭性，化疗耐药性，放疗抵抗性，目前仍无有效预防复发的手段[7]。RNA干涉技术近年来发展迅猛，由于其操作简单，对靶基因表达抑制具有特异性、高效性，使其成为抗肿瘤治疗研究的有力手段[8]。本研究发现脑胶质瘤组织CPEB4的蛋白和mRNA表达明显升高，且随肿瘤级别的增加，

表7 3组瘤体体积、重量和肿瘤抑制率比较Table 7 Comparison of tumor volume，weight and tumor inhibition rate among 3

图5 干扰CPEB4对胶质瘤细胞系U87的克隆形成及侵袭性 1：为空白组；2：对照siRNA组；3：CPEB4 siRNA-3干扰组；A：U87的克隆形成试验；B：U87的侵袭试验Figure 5 Clone formation and invasiveness of glioma cell line U87 interfered with CPEB4．1：blank group；2：control siRNA group；3：clone of CPEB4 siRNA-3 interference group．A：U87 formation experiment；B：U87 invasion experiment

图6 在体干扰CPEB4效率检测 A：空白组；B：对照siRNA组；C：CPEB4 siRNA-3干扰组Figure 6 In vivo interference detection of CPEB4 efficiency．A：blank group；B：control siRNA group；C：CPEB4 siRNA-3 interference group

图7 干扰CPEB4对种植胶质瘤生长情况 A：空白组；B：对照siRNA组；C：CPEB4 siRNA-3干扰组Figure 7 Growth of CPEB4 in planting glioma．A：blank group；B：control siRNA group，and；C：CPEB4 sirna-3 interference group

其表达水平也显著增加。在体干涉CPEB4显著降低肿瘤的体积和质量。这些结果提示CPEB4基因可能在脑胶质瘤的发生发展中发挥重要作用，异常高表达的CPEB4可能是导致脑胶质瘤恶化的重要分子基础。

肿瘤的发生是一个复杂的过程，也是多基因调控的过程[9]。CPEB4是一种与胶质瘤发生发展密切相关的基因，CPEB4在肿瘤生长、血管生成和肿瘤侵袭中发挥重要作用[10]。有报道发现胰腺导管癌和胶质母细胞瘤中CPEB4的表达显著增加[11]。CPEB4阳性表达与胶质瘤恶性程度有关，并可作为考察胶质瘤患者预后情况的重要指标[12-13]。本研究免疫组化、Western blot和Real-Time PCR结果显示脑胶质瘤组织CPEB4的蛋白和mRNA表达明显升高，随着WHO分级的增加，CPEB4的蛋白和mRNA水平也显著增加，表明胶质瘤组织和细胞的CPEB4水平异常高表达，CPEB4的异常表达可能与胶质瘤细胞发生发展密切相关。

RNA干扰技术以其快速、高效、操作简单等特点被广泛应用于基因功能的研究及疾病的基因治疗[14]。目前RNA干扰技术已被广泛应用于基因功能鉴定、基因表达转录后调控等热门研究领域，同时也为多种疾病特别是肿瘤的基因治疗提供了新的思路[15]。本研究利用RNA干扰技术，定向抑制胶质瘤中CPEB4基因的表达，结果显示体外干扰CPEB4可显著降低胶质瘤细胞系U87的集落形成数和侵袭细胞数，在体干涉CPEB4显著降低肿瘤的体积和质量，表明CPEB4基因可能成为治疗胶质瘤的重要靶点。

脑胶质瘤组织高表达CPEB4基因，在体干涉CPEB4显著抑制脑胶质瘤细胞的生长，CPEB4可能成为治疗胶质瘤的重要靶点，靶向CPEB4基因有望成为治疗胶质瘤基因的新的途径和策略[16-18]。尽管目前尚存在种种机制未被阐明，相信随着基础医学研究的发展，CPEB4在肿瘤中的重要作用及机制会被清晰地阐明，并完全有可能成为临床肿瘤治疗的新靶点，广泛应用于肿瘤的基因治疗、生物治疗，给肿瘤的彻底治愈带来新的希望。