茵陈五苓散对实验性梗阻性黄疸大鼠肝损伤的保护作用

张伟，赵卫华，徐云兴，王红坡

梗阻性黄疸（Obstructive Jaundice，OJ）是指胆道系统发生梗阻后，导致胆红素或游离胆红素返流入血，并出现巩膜黄染的现象［1-2］。王婷、许卫娜［3］研究表明：持续性的OJ 对肝脏有较大的影响，严重会导致肝脏纤维化和肝硬化。目前使用中药治疗OJ效果较为突出［4］。中医认为黄疸湿热结于脾胃，熏蒸肝胆，故治则不外清热利湿［5］。茵陈五苓散中包含茵陈、泽泻、茯苓片、猪苓、白术、桂枝等药物，可以提高机体的抗氧化作用同时防止肝脏纤维化和肝炎。本研究旨在探究茵陈五苓散对实验性OJ 大鼠肝损伤的保护作用及保护机理。

茵陈五苓散对实验性梗阻性黄疸大鼠肝损伤的保护作用

1 材料与仪器

1.1 动物2017年1月至2019年5月，60只SPF级雄性SD 大鼠，购自广东省医学动物实验中心，粤监证字2004A029号，饲养温度20～25 ℃，本研究经过伦理委员会批准且遵循动物实验3-R原则。

1.2 药物与试剂茵陈、泽泻、茯苓片、猪苓、白术、桂枝，均购自武汉市中医院；丙二醛（Malondialdehyde，MDA）试剂盒和超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）试剂盒购自江莱生物有限公司；B淋巴细胞瘤-2 蛋白（Bcl-2，货号 sc-56015，批号20181203）、Bcl-2相关X蛋白（Bax，货号sc-20067，批号20190102）、半胱氨酸天门冬氨酸特异性蛋白酶（Caspase-3，货号sc-56053，批号20190201）一抗购于美国Santa Cruz公司；钙蛋白酶［Calpain，货号EY-（K）-1003，批号12582012］一抗购自上海一研；HRP羊抗鼠IgG、HRP羊抗兔IgG购于美国Thermo公司。

1.3 仪器Sysmex-chemix-180 型全自动生化分析仪购自日本Furuno Electric 公司；BS-124s 型电子天平购自北京赛多斯仪器系统有限公司；SG-51 正置型金相显微镜购自上海光学仪器厂；蛋白电泳及转膜仪购自美国Bio-Rad 公司；凝胶成像系统购于以色列DNR 公司；LD-66 实验室切片机购自长沙益广制药机械公司。

2 方法

2.1 造模及药物干预将60 只大鼠适应性喂养1周，采用随机数字表法将大鼠分为：对照组、模型组、低剂量茵陈五苓散组和高剂量茵陈五苓散组，每组各15 只；除对照组外各组大鼠制成实验性OJ大鼠模型；造模具体方法参考韩德兰等［6］研究。完成造模后12 h，低剂量茵陈五苓散组和高剂量茵陈五苓散组使用对应浓度茵陈五苓散灌胃。茵陈五苓散组成：茵陈30 g、茯苓片15 g、猪苓15 g、白术15 g、桂枝10 g水煎；低剂量茵陈五苓散组灌胃剂量为10 g·kg-1·d-1；高剂量茵陈五苓散组灌胃剂量为20 g·kg-1·d-1；对照组和模型组使用等量生理盐水灌胃，连续15 d。

2.2 检测项目

2.2.1一般情况的观察 药物干预完成后立即称大鼠体质量，处死并检测肝脏相关质量计算肝指数。肝指数＝肝脏湿质量/体质量×100%。

2.2.2大鼠肝功能指标检测 各组大鼠眼球取血，按照检测试剂盒说明书方法检测各组大鼠丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、血清总胆红素（TBIL）和内毒素（ET）水平。

2.2.3大鼠氧化应激指标监测 取大鼠肝组织，剪碎并使用胰蛋白酶制成匀浆，试剂盒说明书操作，检测定大鼠肝组织中SOD、MDA含量水平。

2.2.4蛋白质印迹法检测蛋白表达水平 使用蛋白质印迹法检测 Bcl-2、Bax、Caspase-3 和钙蛋白酶表达水平。取大鼠肝脏组织，使用胰蛋白酶消化后，提取总蛋白并转移到PVDF 膜上加入置脱脂奶粉室温封闭，并加入稀释后的Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白抗体，稀释比例1：500，内参蛋白实验β-actin，稀释比例为1∶1 000，分析比较各目的蛋白与内参蛋白条灰度，计算各蛋白相对表达量。

2.3 统计学方法本研究数据分析采用软件为SPSS 22.0，作图采用软件为GraphPad Prism 5，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法；若P＜0.05则表明差异有统计学意义。

3 结果

3.1 大鼠体质量及肝指数检测结果由表1 可以看出，相比对照组，模型组大鼠体质量、肝指数显著升高（P＜0.01）；相比模型组，低剂量茵陈五苓散组和高剂量茵陈五苓散组大鼠体质量、肝指数显著降低（P＜0.01），且高剂量茵陈五苓散组显著低于低剂量茵陈五苓散组（P＜0.01）。

表1 大鼠60只体质量及肝指数检测结果/±s

表1 大鼠60只体质量及肝指数检测结果/±s

注：与对照组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.01；与低剂量茵陈五苓散组比较，cP＜0.01

组别对照组模型组低剂量茵陈五苓散组高剂量茵陈五苓散组鼠数15 15 15 15体质量/g 385.22±38.21 485.78±55.54a 420.11±49.21b 398.79±39.99bc肝指数2.04±0.12 3.21±0.14a 2.53±0.17b 2.11±0.13bc

3.2 大鼠肝脏指标检测结果相比空白对照组，模型组大鼠ALT、AST、TBILTBIL、ET水平均显著升高（P＜0.01）；相比模型组，低剂量茵陈五苓散组和高剂量茵陈五苓散组大鼠ALT、AST、TBILTBIL、ET水平均显著降低（P＜0.01），且高剂量茵陈五苓散组显著低于低剂量茵陈五苓散组（P＜0.01）。见表2。

3.3 大鼠肝脏内氧化物质检测结果相比空白对照组，模型组大鼠MDA 含量水平显著升高（P＜0.01），SOD 水平显著降低（P＜0.01）；相比模型组，低剂量茵陈五苓散组和高剂量茵陈五苓散组大鼠MDA 含量水平显著降低（P＜0.01），且高剂量茵陈五苓散组显著低于低剂量茵陈五苓散组（P＜0.01），SOD 水平显著升高且高剂量茵陈五苓散组显著高于低剂量茵陈五苓散组（P＜0.01）。见表3。

表2 大鼠60只肝脏指标检测结果/±s

表2 大鼠60只肝脏指标检测结果/±s

注：ALT 为丙氨酸氨基转移酶，AST 为天冬氨酸氨基转移酶，TBIL 为血清总胆红素，ET 为内毒素。与对照组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.01；与低剂量茵陈五苓散组比较，cP＜0.01

组别对照组模型组低剂量茵陈五苓散组高剂量茵陈五苓散组鼠数15 15 15 15 ALT（U/L）72.30±7.21 212.02±30.00a 130.50±12.05b 93.15±10.25bc AST（U/L）42.30±8.20 200.15±42.40a 125.55±20.95b 83.47±12.27bc TBIL（µmol/L）9.31±1.30 188.58±20.10a 100.10±10.38b 72.30±10.25bc ET（EU/mL）0.33±0.03 0.77±0.03a 0.52±0.03b 0.40±0.03bc

表3 大鼠肝脏内氧化物质检测结果/（U/mg，±s）

表3 大鼠肝脏内氧化物质检测结果/（U/mg，±s）

注：MDA为丙二醛，SOD为超氧化物歧化酶。与对照组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.01；与低剂量茵陈五苓散组比较，cP＜0.01

组别对照组模型组低剂量茵陈五苓散组高剂量茵陈五苓散组鼠数15 15 15 15 MDA 8.31±2.10 19.00±4.20a 13.50±3.21b 9.26±2.20bc SOD 310.54±44.05 220.78±45.65a 200.47±27.15b 270.15±32.06bc

3.4 大鼠肝脏组织凋亡蛋白水平检测结果相比空白对照组，模型组大鼠Bax 蛋白表达水平和Caspase-3 蛋白表达水平均显著升高（P＜0.01），Bcl-2蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）；相比模型组，低剂量茵陈五苓散组和高剂量茵陈五苓散组大鼠Bax 蛋白表达水平和Caspase-3 蛋白表达水平均显著降低（P＜0.01），且高剂量茵陈五苓散组显著低于低剂量茵陈五苓散组（P＜0.01），Bcl-2 蛋白表达水平显著升高且高剂量茵陈五苓散组显著高于低剂量茵陈五苓散组（P＜0.01）。见图1和表4。

表4 大鼠肝脏组织凋亡蛋白水平检测结果/±s

表4 大鼠肝脏组织凋亡蛋白水平检测结果/±s

注：Bcl-2为B淋巴细胞瘤-2蛋白，Bax为Bcl-2相关X蛋白，Caspase-3 为半胱氨酸天门冬氨酸特异性蛋白酶，β-actin 为β-肌动蛋白。与对照组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.01；与低剂量茵陈五苓散组比较，cP＜0.01

组别对照组模型组低剂量茵陈五苓散组高剂量茵陈五苓散组鼠数15 15 15 15 Bcl-2/β-actin值1.45±0.21 0.45±0.10a 0.69±0.23b 0.75±0.10bc Bax/β-actin值0.25±0.09 1.39±0.21a 1.00±0.15b 0.90±0.11bc Caspase-3/β-actin值0.45±0.12 1.60±0.30a 1.20±0.20b 1.00±0.19bc

3.5 大鼠钙蛋白酶蛋白表达水平检测结果相比空白对照组，模型组大鼠钙蛋白酶蛋白表达水平显著升高P＜0.01）；相比模型组，低剂量茵陈五苓散组和高剂量茵陈五苓散组大鼠肝组织钙蛋白酶蛋白表达水平显著降低（P＜0.01），且高剂量茵陈五苓散组显著低于低剂量茵陈五苓散组（P＜0.01）。见图2和表5。

表5 大鼠钙蛋白酶蛋白表达水平检测结果/±s

表5 大鼠钙蛋白酶蛋白表达水平检测结果/±s

注：Calpain 为钙蛋白酶，β-actin 为β-肌动蛋白。与对照组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.01；与低剂量茵陈五苓散组比较，cP＜0.01

组别对照组模型组低剂量茵陈五苓散组高剂量茵陈五苓散组鼠数15 15 15 15 Calpain/β-actin值1.00±0.20 1.80±0.25a 0.75±0.15b 0.45±0.10bc

4 讨论

肝脏损伤重要指标包括：血清ALT、AST 活力等。黄新造等［7］研究表明：血清 ALT、AST 活力可以一定程度上反映肝脏受损程度。本研究中可以看出，相比模型组，使用茵陈五苓散处理的各组组大鼠ALT、AST 水平均显著降低说明了茵陈五苓散可以有效降低肝细胞的受损程度。这可能是因为茵陈五苓散以茵陈为君药，配合泽泻、猪苓具有清热解毒利湿、健脾化浊之功，同时茵陈是利胆退黄的主药，可以减轻肝细胞坏死的程度，促进胆汁分泌降低血清中的ALT 及AST 水平。杨建桥、严清和［8］研究表明：茵陈五苓散可以降低ALT 及AST 水平，保护小鼠肝组织，本研究得出的结论与其相类似。

发生OJ 会使得肠粘膜屏障受到损害，使得大量的ET 会进入血液，进一步加重黏膜屏障的受损程度，并形成恶性循环［9］。TBIL是由体内红细胞裂解而释放出的血红蛋白产生的，主要包括间接胆红素和直接胆红素［10］。耿焱等［11］研究表明：检查TBIL 含量水平不仅能反映肝脏损害的程度，尤其对黄疸的鉴别具有重要意义，胆汁淤积会引起黄疸，TBIL 含量水平显著升高。本研究发现相比模型组，使用茵陈五苓散处理的各组大鼠TBIL 和ET水平均显著降低说明了茵陈五苓散可以有效保护肠粘膜屏障。同时茵陈五苓散可以防止大量的胆酸及胆红素淤积导致肝脏湿热毒邪蕴积，影响血气运行，从而造成肝细胞受损。王缚鲲等［12］研究表明：TBIL 是预测减黄效果的最佳指标，降低其含量可有效缓解OJ，本研究得出的结论与其相类似。

随着医疗的进步，对活性氧的研究越来越深入，研究发现若发生氧化应激反映会使得MDA的水平升高，同时自由基清除剂如SOD、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）等会严重减少或缺乏，同时还会影响细胞膜的通透性细胞内的SOD、GSH-Px 等酶释放至细胞外［13］。MDA 也是反应体内脂质氧化的重要指标［14］。本研究发现，相比模型组，使用茵陈五苓散处理的各组大鼠MDA含量水平显著降低，SOD水平显著升高，说明大鼠体内的脂质氧化受到了显著的抑制，同时氧自由基也显著减少，这可能是因为茵陈五苓散中包含的茯苓片、白术等中药具有抗氧化、清除自由基的效果。胡明华等［15］研究表明：降低自由基的含量水平可以有效保护OJ病人肝脏，本研究得出的结论与其相类似。

OJ 会损伤肝细胞，使得肝脏纤维化并促进肝细胞的程序性死亡，细胞的凋亡受到基因的调控，其中Caspase 家族是细胞凋亡的核心。Caspase 家族中Caspase-3 和Caspase-9 是重要的凋亡基因，可以启动细胞的凋亡程序［16］。除了Caspase 家族蛋白可以调控细胞的凋亡，Bcl-2 家族蛋白也可以调控细胞的凋亡，在Bcl-2 家族中主要由Bcl-2 蛋白和Bax 蛋白分别抑制和促进细胞的凋亡［18-20］。本研究发现，相比模型组，使用茵陈五苓散处理的各组大鼠Bax 蛋白表达水平和Caspase-3 蛋白表达水平均显著降低，Bcl-2 蛋白表达水平显著升高，说明使用茵陈五苓散处理后可以显著降低大鼠肝脏细胞的凋亡，有效保护发生OJ 后的肝细胞。

钙蛋白酶是一种降解蛋白的酶，会降解肌原纤维中的蛋白，在OJ 病人肝组织内其表达会显著增加，且与肝脏受损程度正相关［21］。本实验发现，相比模型组，使用茵陈五苓散处理的各组大鼠肝组织钙蛋白酶蛋白表达水平显著降低，说明大鼠肝脏损伤得到了有效的缓解，这些可能和降低肝脏炎性细胞浸润及成纤维细胞的增生有关。崔玉宝［21］研究表明：使用茵陈五苓散可以降低肝脏组织内的钙蛋白酶基因及蛋白的表达并促进肝脏功能恢复。

综上所述，茵陈五苓散可以有效保护实验性OJ大鼠肝脏，其作用机制与抑制氧化应激、钙蛋白酶的表达及肝细胞的凋亡相关。但本研究使用的剂量梯度较少，在后续的研究中将进一步探讨茵陈五苓散的剂量对实验性OJ大鼠肝脏保护的效果。

（本文图1，2见插图10-2）