三相盐析萃取分离辣椒红色素和辣椒碱及不同辣椒品种的聚类分析

范三红，王娇娇，白宝清，张锦华

（1.山西大学生命科学学院，山西 太原 030006；2.特色植物资源研究与利用山西重点实验室（山西大学），山西 太原 030006）

辣椒红色素是从成熟的辣椒果实中提取出的一种天然色素，在食品添加剂和美妆领域发展潜力巨大[1]。辣椒红色素因包含有辣椒红素、玉米黄质素和β-胡萝卜素等，故具有VA的活性。研究表明辣椒红色素具有抗氧化、调节免疫系统活性和预防辐射等重要的生理功能[2-3]。辣椒碱是辣椒中主要辛辣成分，已成为国际上主要的香辛料之一。辣椒碱类物质具有消炎镇痛、抑菌等生理活性[4]。Kang等[5]研究表明辣椒碱减轻脂肪组织的炎性反应，改善胰岛素耐受反应，进一步降低血脂代谢。因此，提取分离得到高质量的辣椒红色素和辣椒碱，并对辣椒红色素和辣椒碱进行定量定性分析具有一定的现实意义。

目前针对辣椒红色素和辣椒碱的提取分离方法研究较多，多采用有机溶剂提取法、超声波或微波辅助提取法和超临界CO2萃取法等[6-7]，但对同时萃取分离得到2 种目标产物的研究较少[8-9]。盐析萃取是一种新兴的绿色萃取技术[10]，现已被充分应用于天然产物有效成分的提取[11]。范勇等[12]采用双水相体系L44/Na2CO3/乙醇提取辣椒碱，通过正交试验优化各因素，辣椒碱提取率达到95.6%。Dang Yanyan等[13]研究采用三液相体系分离辣椒红素和辣椒碱，辣椒红素和辣椒碱的产率分别为常规溶剂提取的105%和88%。本实验研究超声辅助石油醚-乙腈-K2HPO4三相盐析萃取体系同时分离得到辣椒红色素和辣椒碱，并采用响应面法优化体系参数。

高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）作为一种能准确、灵敏检测天然产物有效成分含量的分析方法，已较多应用于辣椒碱的检测分析[14-15]，而辣椒红色素的检测还主要是常规的分光光度计法等[16]，其准确性较低。本实验在响应面优化超声辅助三液相萃取同时分离辣椒红色素和辣椒碱的基础上，结合HPLC法对33 种不同品种辣椒样品中的辣椒红色素和辣椒碱含量进行测定，并运用聚类分析法进行分析。以期为辣椒红色素和辣椒碱的萃取分离及其深入研究提供理论基础，为选育优质辣椒品种提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

不同品种辣椒（编号c1、c100、c104、c105、c107、c116、c121、c123、c126、c22、c24、c25、c27、c29、c3、c30～c33、c35、002A、004A2、005A1、f1、f4、f5、s16、s3、s4、y126-2、y13-1、y29），由山西省农科院蔬菜研究所提供。

甲醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷、石油醚（沸点60～90 ℃）、氯仿、无机盐等均为分析纯；甲醇、乙腈、二氯甲烷均为色谱纯；辣椒红素（98%）、玉米黄质素（97%）、β-胡萝卜素（97%）、辣椒碱（99%）、二氢辣椒碱（98%）、降二氢辣椒碱（98%）均购于百灵威科技有限公司。

1.2 仪器与设备

WJX-800A型高速多功能粉碎机 上海缘沃工贸有限公司；AL204电子分析天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；SB-5200DT型超声波清洗器 宁波新芝生物科技股份有限公司；1260 Infinity II高效液相色谱仪美国安捷伦公司。

1.3 方法

1.3.1 三相盐析萃取体系的构建

研究不同无机盐种类与不同极性的有机溶剂的成相情况。选取K2HPO4、Na2CO3、KH2PO4三种无机盐与极性较大的甲醇、乙腈和丙酮，以及极性较小的二氯甲烷、石油醚和氯仿等有机溶剂形成三液相萃取体系。发现KH2PO4与任意2 种有机溶剂均不能形成三相盐析体系，Na2CO3可以形成三相体系，但是成相效果差，盐极易析出形成沉淀。而K2HPO4与上述有机溶剂均可形成三相盐析萃取体系，故选择K2HPO4作为后续研究盐析体系的无机盐。

1.3.2 萃取分离

干辣椒洗净、烘干，粉碎后过45 目筛。向20 mL的具塞试管中加入0.5 g辣椒粉末和K2HPO4质量分数20%、乙腈质量分数20%、石油醚质量分数16%，加蒸馏水至质量分数为100%，充分混匀，45 ℃超声辅助萃取，待静置三相分离后，分别读取上、中相体积，并取两相萃取液进行HPLC分析测定含量，按下式计算提取量（Y）：

式中：C为辣椒红色素或辣椒碱各单组分质量浓度/（mg/mL）；V为目标物所在相的体积/mL；M为辣椒粉末质量/g。

1.3.3 单因素试验

考察超声温度（35、40、45、50、55 ℃）、超声时间（5、10、15、20、25 min）和萃取方式（1：三相混匀后加入样品；2：样品和有机溶剂混匀后加入盐；3：盐和乙腈、样品混匀后加入石油醚；4：盐和石油醚、样品混匀后加入乙腈）对体系中辣椒红色素和辣椒碱分离萃取的影响，确定最优萃取条件。

1.3.4 响应面试验优化萃取分离条件

在单因素试验的基础上，以辣椒红色素提取量和辣椒碱提取量为指标，进行响应面试验优化萃取分离工艺条件。试验因素及水平见表1。

表1 Box-Behnken试验因素与水平Table 1Factors and their levels used for Box-Behnken design

1.3.5 HPLC法测定萃取相中辣椒红色素和辣椒碱浓度

1.3.5.1 标准品溶液制备

精密称取辣椒红色素各组分标准品和辣椒碱各组分标准品适量，分别用正己烷和乙腈溶解，制成1 mg/mL标准品储备液，并用0.45 μm微孔滤膜过滤后待用。

1.3.5.2 样品溶液制备

准确称取辣椒样品粉末0.5 g，按1.3.2节方法进行萃取分离，分别取上相和中相萃取液过0.45 μm微孔滤膜，滤液取10 μL上机测定。

1.3.5.3 色谱条件

辣椒红色素测定：ZORBAX RX-SIL色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：A为甲醇，B为乙腈，C为二氯甲烷，A-B-C（5∶10∶85，V/V），等度洗脱，流速1 mL/min；柱温30 ℃；检测波长：辣椒红素为475 nm，β-胡萝卜素和玉米黄质素为450 nm；以峰面积外标法定量。标准品溶液与样品溶液进样量均为10 μL。

辣椒碱测定：ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水（70∶30，V/V），流速1 mL/min；柱温30 ℃；检测波长280 nm；以峰面积外标法定量。标准品溶液与样品溶液进样量均为10 μL。

1.4 数据处理

利用Origin软件进行数据、图形处理，采用Design-Expert V8.0.6软件进行响应面试验数据分析，利用SPSS 20.0软件对33 种辣椒样品中辣椒红色素和辣椒碱含量进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 辣椒红色素和辣椒碱的标准品曲线

按HPLC条件进行测定，对一系列辣椒红色素和辣椒碱标准品溶液进行分析，以峰面积（Y）对标准品溶液系列质量浓度（X）进行回归，β-胡萝卜素、辣椒红素和玉米黄质素标准溶液质量浓度与峰面积的线性回归方程分别为Y=31 475X＋55.186（R2=0.998 1）、Y=26 296X＋198.22（R2=0.998 5）、Y=31 051X＋42.171（R2=0.996 3）；降二氢辣椒碱、辣椒碱和二氢辣椒碱标准溶液质量浓度与峰面积的线性回归方程分别为Y=2 629.6X＋10.989（R2=0.998 2）、Y=4 305.2X＋15.598（R2=0.997 9）、Y=1 293.5X＋7.835（R2=0.993 6），表明峰面积与待测物呈现良好的线性关系[17]。

2.2 三相盐析萃取体系的确立

2.2.1 K2HPO4质量分数对辣椒红色素和辣椒碱分离的影响

图1 K2HPO4质量分数对辣椒红色素和辣椒碱分离的影响Fig.1 Effect of dipotassium phosphate concentration on the separation of capsanthin and capsaicin

当乙腈质量分数为20%、石油醚质量分数为16%时，考察K2HPO4不同质量分数对辣椒红色素和辣椒碱分配行为及提取量的影响。由图1可知，随着K2HPO4质量分数的增大，辣椒碱提取量逐步上升后略下降，这是因为随着K2HPO4质量分数的增大，中相极性增大，辣椒碱富集量增大。辣椒红色素提取量变化不大，在K2HPO4质量分数为20%时达到最大值。因此，选择20%为三相体系的最佳K2HPO4质量分数。

2.2.2 乙腈质量分数对辣椒红色素和辣椒碱分离的影响

图2 乙腈质量分数对辣椒红色素和辣椒碱分离的影响Fig.2 Effect of acetonitrile concentration on the separation of capsanthin and capsaicin

当体系中K2HPO4质量分数20%、石油醚质量分数16%时，考察乙腈质量分数对辣椒红色素和辣椒碱分离的影响，如图2所示。由于辣椒红色素类物质极性较小而辣椒碱极性大[18]，乙腈极性比石油醚大[19]，所以辣椒碱几乎全部集中于体系中相。随着乙腈质量分数增大，辣椒碱提取量先增大后下降，在质量分数为22%时达到最大值。同时，辣椒红色素提取量先升高后下降，在20%时取得辣椒红色素提取量最大值，这是由于乙醇质量分数的增大使得上相体积变小，故辣椒红色素浓度变大。由于辣椒碱提取量在乙腈质量分数为20%～22%范围内变化不大，故体系选择乙腈质量分数为20%进行后续研究。

2.2.3 石油醚质量分数对辣椒红色素和辣椒碱分离的影响

图3 石油醚质量分数对辣椒红色素和辣椒碱分离的影响Fig.3 Effect of petroleum ether concentration on the separation of capsanthin and capsaicin

固定K2HPO4质量分数20%和乙腈质量分数20%，考察石油醚质量分数对辣椒红色素和辣椒碱提取量的影响。由图3可知，辣椒碱提取量在石油醚质量分数先增大后减小，在20%时取得最大值，随后下降，造成该现象的原因可能是随着石油醚质量分数增大，中相辣椒碱浓度变大，但当石油醚质量分数超过20%时，辣椒碱溶出已达到饱和，所以提取量降低。而辣椒红色素提取量随石油醚质量分数增大变化不大，但在石油醚质量分数为16%时达到最高点，综合考虑选择石油醚质量分数为16%。

2.3 单因素试验结果

2.3.1 超声温度对目标产物提取量的影响

图4 超声温度对辣椒红色素和辣椒碱分离的影响Fig.4 Effect of temperature on the separation of capsanthin and capsaicin

超声辅助萃取分离辣椒红色素和辣椒碱，既能使分子细胞壁破裂，加速溶剂的浸入，还能产生热量，加速分子运动[20]。如图4所示，随着超声温度升高，辣椒红色素和辣椒碱的提取量均呈上升趋势，且在45 ℃时两者提取量均较高，但温度过高会影响色素和碱类物质的稳定性[21-22]，因此，采用45 ℃作为最佳超声温度。

2.3.2 超声时间对目标产物提取量的影响

图5 超声时间对辣椒红色素和辣椒碱分离的影响Fig.5 Effect of sonication time on the separation of capsanthin and capsaicin

如图5所示，随着超声时间的延长，辣椒碱提取量先增大后减小，在5～10 min内其提取量增长迅速，10 min时辣椒碱提取量达到最大值，10～15 min提取量趋于稳定而后下降。造成这种现象的原因是超声时间过短，不能使物料内部细胞壁破裂。但时间过长，超声波的作用会使目标物遭到破坏，也会使杂质过多溶出。辣椒红色素提取量在5～15 min范围内也呈现先增后减的趋势，但整体范围内变化不大。在10 min时，辣椒红色素提取量达到最大值，且10 min时辣椒碱提取量与最大值相差不大，故选择10 min为最适超声时间。

2.3.3 萃取方式对目标产物提取量的影响

图6 萃取方式对辣椒红色素和辣椒碱分离的影响Fig.6 Effects of mixing sequence on the separation of capsanthin and capsaicin

由图6可知，不同萃取方式下对辣椒碱和辣椒红色素提取量的影响不大。萃取方式2条件下辣椒红色素和辣椒碱提取量均较高，这是因为样品与有机溶剂的事先混合，使得目标产物能较多地溶出，故选择先将样品粉末和乙腈石油醚混合后再加入K2HPO4进行盐析分离。

2.4 响应面试验结果

2.4.1 响应面试验设计与结果

运用Design-Expert V8.0.6软件程序对表2数据进行回归分析，拟合后得到超声温度、超声时间、萃取方式对辣椒碱提取量和辣椒红色素提取量的二次回归模型分别为：辣椒红色素提取量=0.26＋0.014A＋0.020B－6.400×10－3C＋5.750×10－4AB－0.020AC－2.250×10－3BC－0.042A2－0.02B2－6.453×10－3C2（R2=0.930 8）；辣椒碱提取量=1.56＋0.026A－9.575×10－3B＋0.044C＋59.400×10－3AB－0.054AC＋0.056BC－0.082A2－0.12B2－0.050C2（R2=0.987 0）。说明模型拟合良好[23-24]。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

2.4.2 方差分析及响应面分析

表3 回归统计分析Table 3 Analysis of variance for each term of the fitted regression equations

图7 各因素交互作用对辣椒碱（a）和辣椒红色素（b）提取量影响Fig.7 Response surface plots showing the interactive effects of various extraction conditions on the yields of capsaicin (a) and capsanthin (b)

如表3、图7所示，响应面图可以直观地评价萃取方式、超声时间和超声温度间的交互作用及对目标产物提取量的影响，响应面图曲率越大，这2 个因素之间的差异就越显著[25]。对于辣椒碱提取量模型，萃取方式的影响为极显著，超声温度影响为显著。同时，由F值的大小可以推断，在所选择的实验范围内，3 个因素对辣椒碱提取量影响的排序为萃取方式＞超声温度＞超声时间，而在辣椒红色素模型中3 个影响因素排序为超声时间＞超声温度＞萃取方式。这表明方差分析结果与响应面图反映结果一致。

2.4.3 验证实验结果

根据Design-Expert软件，对回归方程进行求解，预测出可同时保证辣椒碱和辣椒红色素提取量较高的最佳提取条件：超声温度47.01 ℃、超声时间12.57 min、萃取方式为1（三相溶剂混匀后加入样品粉末）。此条件下辣椒碱和辣椒红色素提取量可高达1.423 mg/g和0.274 mg/g，且模型可信度高。考虑到实验条件的限制及操作的方便性，将各因素修正为超声温度45 ℃、超声时间10 min、萃取方式采用三相溶剂混匀后加入样品，经3 次平行实验后，辣椒碱和辣椒红色素提取量为1.412 mg/g和0.263 mg/g，与模型预测值无明显差异。

2.5 辣椒红色素和辣椒碱的HPLC测定

图8 混合标准品和辣椒样品的HPLC分析Fig.8 HPLC analysis of mixed standards and capsanthin and capsaicin from chili pepper samples

从图8可以看出，经响应面优化后的石油醚-乙腈-K2HPO4三相盐析萃取体系萃取分离后，进行HPLC分析。在体系上相，即辣椒红色素相中没有辣椒碱类物质。同时在体系的中相，即辣椒碱相，也几乎检测不到辣椒红色素的各组分物质。表明该三相盐析体系可用于同时萃取分离得到辣椒红色素和辣椒碱。由图8a、b可知，辣椒红色素3 个组分根据出峰时间依次为β-胡萝卜素、辣椒红素和玉米黄质素，样品中辣椒红色素各组分出峰时间与标准品一致，样品中β-胡萝卜素和辣椒红素峰形良好但由于2 种物质极性相近，较难分离完全[26-27]。图8d可以看出，辣椒碱各组分标准品从左到右依次为降二氢辣椒碱、辣椒碱和二氢辣椒碱，样品中3 种辣椒碱单体组分出峰时间与标准品各组分辣椒碱一致，且分离完全、峰形良好。

2.6 辣椒样品辣椒红色素和辣椒碱含量检测结果与分析

2.6.1 辣椒样品中辣椒红色素和辣椒碱含量检测结果

表4 辣椒样品中辣椒红色素和辣椒碱含量Table 4 Contents of capsanthin and capsaicin in chili peppers

如表4所示，辣椒红色素含量范围为0.011～0.686 mg/g，c126样品含量最低；辣椒碱的含量范围为0.030～4.705 mg/g，c31样品含量最低。

2.6.2 33 种辣椒样品中辣椒红色素和辣椒碱含量的聚类分析

图9 33 种辣椒样品中辣椒红色素（a）和辣椒碱（b）含量的聚类分析Fig.9 Cluster analysis of capsanthin (a) and capsaicin (b) contents in 33 varieties of chili pepper

对33 种辣椒样品的辣椒红色素和辣椒碱含量进行聚类分析[28]，采用系统聚类，形成树状聚类图。如图9a所示，以辣椒红色素含量为指标，欧氏距离为5时，辣椒品种可以分为三大类。编号003A和s4的辣椒红色素含量高，为第1类；c22、s3、c25、c3和005A1为第2类，辣椒红色素含量在0.260～0.413 mg/g范围内；其余品种辣椒红色素含量较低，归为第3类。以辣椒碱含量为聚类变量（图9b），当欧氏距离为5时，辣椒品种也被分为三大类群。c100和c105的辣椒碱含量最高，聚为一类，分别为4.498 mg/g和4.705 mg/g；第2类（包括003A、c22、c126、c104、c27、y13-1、c3、005A1和s4）辣椒品种的辣椒碱含量平均为2.237 mg/g；第3类包含22 种辣椒品种，其辣椒碱含量均较低。

3 结 论

采用超声辅助三相盐析萃取体系对辣椒中的辣椒红色素和辣椒碱进行同时萃取分离，在构建最优盐析体系组成的基础上，考察萃取条件即超声温度、超声时间和不同萃取方式对目标产物提取量的影响。运用响应面试验设计优化工艺条件，获得一种较优的同时分离得到辣椒红色素和辣椒碱的三相萃取方法[29-30]。

三相盐析体系为44%蒸馏水-20% K2HPO4-20%乙腈-16%石油醚，萃取分离辣椒红色素和辣椒碱最佳萃取工艺参数为超声温度45 ℃、超声时间10 min、萃取方式采用三相溶剂混匀后加入样品。萃取分离后，将两萃取相目标物经高效液相色谱分析测定。在此条件下，辣椒红色素和辣椒碱提取量均较高，分别为0.263 mg/g和1.412 mg/g。该法可作为一种温和简便同时分离得到辣椒红色素和辣椒碱的有效方法。采用此方法对33 种辣椒品种的辣椒红色素和辣椒碱含量进行聚类分析，可为今后从植物资源中提取辣椒红色素和辣椒碱类物质及辣椒优质品种的选择提供理论和实验基础。