基于线粒体部分基因序列重构张氏树蛙属系统发育关系

余水生，陈智强，王卫东，张英川，张乃芳，乔 芬

（1.遂昌县林业发展中心,浙江遂昌323300;2.丽水学院生态学院,浙江丽水323000）

物种名录是进行生物多样性研究、保护、利用以及管理的重要基础资料[1]。随着分子技术的发展，越来越多的两栖动物新种和新记录被描述[1]，一些珍稀两栖动物隐存种被证实[2]。仅在2015—2019年间，中国新增两栖动物新记录18种，新描述或恢复有效种74种[1]。同时，基于分子技术证实湍蛙属的物种多样性远被低估[3-4]。因此，依据分子技术确定物种的有效性是可行且具有重要意义的。

张氏树蛙属（Zhangixalus）隶属于无尾目树蛙科，现共记录28种[5]，主要分布于我国在内的东亚地区[1]，是我国东南部动物类群的重要组成部分。其中，丽水树蛙（Z.lishuiensis）、安徽树蛙（Z.zhoukaiyae）、突肛树蛙（Z.pachyproctus）等3种张氏树蛙属新物种在2017—2019年间被描述[6-8]。2019年，Jiang等在线粒体分子系统学研究基础上，结合形态学和生物地理分布情况，将原广义树蛙属（Rhacophorus sensu lato）拆分为3属，即狭义树蛙属（Rhacophorus）、瘦树蛙属（Leptomantis）以及新命名的张氏树蛙属[9]。本研究基于全球28种张氏树蛙属物种的12S rRNA-tRNAval-16S rRNA序列，以2种树蛙科树蛙属物种（双斑树蛙Rhacophorus bipunctatus和黑蹼树蛙R.kio）作为外群，分析张氏树蛙属的系统发育关系，以期确定其物种有效性。

1 研究方法

1.1 序列获取

28种张氏树蛙属（Zhangixalus）及2种树蛙属（Rhacophorus）线粒体部分基因序列均载自GenBank（表1）。

表1 本研究所用分子样品和序列信息

表1 续表

1.2 序列比对与歧异指数

获得的张氏树蛙属28种物种的12S rRNA-tRNAval-16S rRNA部分片段序列，长度为1 784～1 838 bp。序列碱基组成见表2。

表2 张氏树蛙属28种物种12SrRNA-tRNAval-16SrRNA序列的碱基组成

表2 续表

1.3 系统发育树的重建

用MEGA对所下载的30条12S rRNA-tRNAval-16S rRNA的部分序列进行对齐排列并截取长度一致的序列片段，随后用pairwise uncorrected p-distance模型计算各样本间的遗传距离。

系统发育进化树用贝叶斯法（Bayesian Inference,BI）在MrBayes 3.2.2上进行构建。构树前，利用Mr-Modeltest 2.3选择最适碱基替代模型为GTR+I+G，外群设置为树蛙属的双斑树蛙（R.bipunctatus）和黑蹼树蛙（R.kio）。按照上述选择的模型设置参数（Lset Nst=6，Rates=invgamma），随机选取起始树，隐马氏链计算 4次（nchains=4），计算 106代（ngen=1 000 000），每 1 000代保存一棵树（samplefreq=1 000），舍弃前1 000棵树（burn in=1 000），利用剩余的树生成一致树。系统树中结点的置信度由后验概率（posterior probabilities）提供。

2 研究结果

2.1 遗传距离

遗传距离分析结果显示：安徽树蛙与丽水树蛙之间的遗传距离为1.1%；峨眉树蛙（Z.omeimontis）与蓝面树蛙（Z.duboisi）之间的遗传距离也为1.1%；其他张氏树蛙属物种间的遗传距离均大于2.8%（表3）。

29 0.089 28 0.100 0.066 27 0.071 0.095 0.062 26 0.068 0.066 0.095 0.061 25 0.097 0.090 0.097 0.108 0.088 24 0.092 0.059 0.070 0.070 0.098 0.068 23 0.058 0.089 0.059 0.060 0.048 0.092 0.060 22 0.087 0.099 0.109 0.093 0.088 0.097 0.033 0.087 217 0.103 0.097 0.095 0.087 0.096 0.095 0.102 0.11 0.094 2096 0.093 0.060 0.069 0.086 0.064 0.073 0.065 0.093 0.065 0.0离距传遗的列19 18 17 0.093 0.090 0.056 0.061 0.093 0.025 0.095 0.112 0.095 0.088 0.063 0.091 0.051 0.090 0.054 0.058 0.095 0.064 0.094 0.106 0.087 0.051 0.094 0.060 0.055 0.088 0.066 0.055 0.098 0.061 0.092 0.066 0.092 0.044 0.089 0.065序A N rR S val-16 A N tR -A N rR 12S蛙树种30 3 16 15 14 31 12 11 10 9 8 0.043 0.119 0.125 0.121 0.075 0.080 0.081 0.129 0.050 0.059 0.034 0.078 0.120 0.048 0.055 0.041 0.032 0.084 0.128 0.053 0.059 0.058 0.057 0.060 0.073 0.123 0.041 0.028 0.063 0.035 0.037 0.034 0.088 0.129 0.053 0.059 0.064 0.066 0.061 0.049 0.061 0.074 0.124 0.054 0.067 0.102 0.090 0.097 0.090 0.098 0.091 0.135 0.092 0.088 0.056 0.043 0.054 0.049 0.053 0.074 0.119 0.011 0.045 0.066 0.064 0.062 0.052 0.066 0.080 0.125 0.059 0.069 0.100 0.094 0.101 0.098 0.100 0.081 0.133 0.093 0.099 0.093 0.086 0.091 0.090 0.097 0.090 0.137 0.088 0.087 0.047 0.057 0.044 0.037 0.043 0.073 0.120 0.049 0.059 0.070 0.068 0.066 0.065 0.064 0.078 0.130 0.056 0.071 0.101 0.090 0.093 0.091 0.096 0.083 0.135 0.091 0.095 0.067 0.059 0.064 0.059 0.064 0.077 0.118 0.050 0.059 0.070 0.062 0.065 0.065 0.066 0.075 0.126 0.059 0.065 0.037 0.064 0.022 0.041 0.036 0.087 0.127 0.054 0.065 0.098 0.089 0.096 0.092 0.101 0.097 0.130 0.088 0.090 0.064 0.011 0.060 0.058 0.064 0.076 0.122 0.042 0.031表70.086 0.082 0.130 0.081 0.090 0.084 0.085 0.082 0.084 0.089 0.106 0.083 0.090 0.104 0.104 0.085 0.094 0.096 0.091 0.086 0.089 0.108 0.083 6 0.114 0.098 0.098 0.141 0.098 0.105 0.097 0.103 0.097 0.108 0.100 0.074 0.097 0.101 0.113 0.079 0.091 0.103 0.118 0.098 0.098 0.104 0.085 0.098 5 0.089 0.081 0.043 0.031 0.118 0.072 0.050 0.046 0.054 0.039 0.050 0.056 0.088 0.031 0.059 0.091 0.084 0.050 0.059 0.089 0.056 0.058 0.054 0.085 0.042 4 0.043 0.093 0.084 0.053 0.044 0.123 0.068 0.054 0.049 0.058 0.049 0.058 0.052 0.088 0.048 0.054 0.088 0.084 0.047 0.061 0.086 0.053 0.059 0.059 0.086 0.053 3 0.118 0.116 0.132 0.120 0.121 0.119 0.073 0.119 0.121 0.115 0.122 0.122 0.121 0.116 0.135 0.118 0.113 0.136 0.133 0.112 0.124 0.128 0.119 0.123 0.122 0.129 0.124 2.143 0.142 0 0.142 0.165 0.146 0.150 0.146 0.158.141 0.145 0.148 0.144 0.150 0.145 0.144 0.159 0.145 0.144 0.159 0.160 0.147 0.151 0.150 0.146 0.142 0.146 0.163 0.148 0 1 219445）JX（蛙树斑1.双0.086 781700）B A （蛙树蹼2.黑0.142 F066239）M （蛙树纳赫塔坎3.阿0.138 386560）C L （蛙树笠4.衣0.136 215537）U E （蛙树甸5.缅0.165 219432）JX（蛙树甫6.经0.143 215545）U E （蛙树7.大0.145 219423）JX（蛙树背8.绿0.139 219414）JX（蛙树面9.蓝0.154 219434）JX（蛙树利10.杜0.136 4）21554 U E （蛙树褶11.棕0.145 688883）JN（蛙树溪12.巫0.138 0）21554 U E （蛙树氏13.胡0.141 688879）JN（蛙树佛14.洪0.142 653720）Y K （蛙树水15.丽0.142 569）386 C L （蛙树16.侏0.139 386570）C L （蛙树湾17.台0.155 219429）JX（蛙树掌18.黑0.141 5）21553 U E （蛙树眉19.峨0.142 386572）LC（蛙树顿斯20.奥0.151 613222）N M （蛙树翠21.翡0.157 170683）U K （蛙树龙22.平0.140 688884）JN（蛙树洱23.普0.145 369670）C L （蛙树氏24.舒0.148 613214）N M （蛙树大颌25.白0.141 386574）C L （蛙树北26.台0.145 386576）C L （蛙树绿27.翠0.141 688880）JN（蛙树川28.利0.157 322122）G M （蛙树山29.瑶0.144 601499）U K （蛙树徽30.安

2.2 系统发育关系

系统进化树分析表明，张氏树蛙属系统进化树具有两大分支：（1）阿坎塔赫纳树蛙（Z.achantharrhena）和杜利树蛙（Z.dulitensis）聚为根部支系；（2）其他26种张氏树蛙属物种聚为一支（图1）。

图1 基于线粒体部分序列构建的贝叶斯树

3 讨论

在本研究根据12SrRNA-tRNAval-16SrRNA序列构建的系统发育树中，阿坎塔赫纳树蛙和杜利树蛙聚为根部支系，其他26种张氏树蛙属物种聚为一支。这个结论与Jiang等人[9]的研究结果相似，说明线粒体基因序列具有较强保守性的特点。

序列的差异性导致界定种水平的标准也有所不同[10]。Kon等[11]和Camargo等[12]认为在以16S rRNA作为分子标记时，当种群遗传距离超过2%，即认定达到了种的水平；陈智强等[10]将遗传距离为1.4%的两个样本认定为北仑姬蛙（Microhyla beilunensis）的两个不同地理种群。金义文等[13]将12S和16S rRNA的遗传距离为1.1%的两个不同地区的湍蛙样本判定为同一物种的两个不同种群。本研究结果显示，安徽树蛙与丽水树蛙、峨眉树蛙与蓝面树蛙之间的遗传距离仅为1.1%，低于使用16S rRNA作为分子标志的种间识别的最低差异程度。从系统发育树上看，安徽树蛙与丽水树蛙、峨眉树蛙与蓝面树蛙相互聚合。同时，关于蓝面树蛙的分类存在诸多争议。该物种在2000年被命名[14]。在2001年被发现并被命名的屏边泛树蛙（Polypedates pingbianensis）[15]以及2008年被描述成新种的棘皮泛树蛙（P.spinus）[16]均被认为是蓝面树蛙的同物异名。《中国动物志：两栖纲》中，屏边泛树蛙则被认为是峨眉树蛙的同物异名[17]。综上所述，我们推测安徽树蛙与丽水树蛙、峨眉树蛙与蓝面树蛙均为同物异名或亚种。

本研究使用的序列为12S rRNA-tRNAval-16S rRNA，未采用其他基因（如COΙ）进行进一步的序列对比，故将安徽树蛙与丽水树蛙、峨眉树蛙与蓝面树蛙认定为同物异名或亚种的合理性有待后续新的分子标记技术、生活史特征等方面的比较研究。