具有优秀抗肿瘤活性的香豆素杂合体

(浙江仙居君业药业有限公司,仙居 317300)

1 前言

众所周知，自然界蕴藏着丰富的药物资源，是新药的重要来源，如80%的抗肿瘤药物源自天然产物及其衍生物[1-2]。香豆素(图1,2H-1-苯并吡喃-2-酮)结构片段广泛存在于天然产物中，其衍生物可通过抑制表皮生长因子受体(EGFR)、端粒酶、蛋白激酶、硫酸酯酶、碳酸酐酶、芳香化酶、微管蛋白和单羧酸转运蛋白等诱导肿瘤细胞凋亡，对包括耐多药肿瘤细胞在内的多种肿瘤细胞具有良好的活性[3-5]。特别值得一提的是，香豆素衍生物Irosustat(STX64,BN83495)可阻止雌激素的分泌，具有良好的抗乳腺癌活性[6-7]。目前，本品正处于临床评价阶段，有望于不久的将来为人类健康服务。由此可见，香豆素类化合物在抗肿瘤新药研发领域占据重要位置。

本文将着重介绍自2015年以来所发现的具有优秀体内外抗肿瘤活性(半抑制浓度或50%生长抑制所需的药物浓度＜10μmol/L或具有潜在体内活性)的香豆素杂合体(包括香豆素-查耳酮、香豆素-唑、香豆素-吲哚/喹啉和香豆素-氧化呋咱等杂合体)的研究进展，并总结了构-效关系(SAR)和作用机制，为进一步研究提供理论支持。

图1 香豆素母核和Irosustat的化学结构

2 香豆素-查耳酮杂合体

香豆素-查耳酮杂合体1(图2,IC50:0.65～2.02μmol/L)的抗K562和HepG2肿瘤细胞活性优于对照药阿霉素、卡贝塔汀和顺铂(IC50:2.02～4.93μmol/L)[8]。作用机制研究结果表明，这类杂合体可激活半胱天冬酶-3和-9、提升促凋亡蛋白Bax水平和降低B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)水平，阻滞肿瘤细胞G2/M期，诱导细胞凋亡。其中，代表物1a(IC50:0.65和1.09μmol/L)不仅抗K562和HepG2肿瘤细胞活性最高，而且对正常WI-38细胞的毒性(IC50:292.7μmol/L)极低，选择性指数268。总之，良好的活性和安全性使得该杂合体极具进一步研发前景。

进一步研究发现，向香豆素母核的7号位引入二乙胺基所得的杂合体2a,b(IC50:3.60和3.91μmol/L)也具有良好的抗HCT-116细胞活性，其活性是黄腐酚(IC50:27.60μmol/L)的8倍左右[9]。作用机制研究结果表明，杂合体2a可促使活性氧(ROS)的产生激活线粒体凋亡途径，进而抑制肿瘤细胞转移和破坏集落形成能力，进而诱导肿瘤细胞凋亡。

香豆素-查耳酮杂合体3a(IC50:2.32μmol/L)的抗HepG2细胞活性是对照药索拉非尼(IC50:7.52μmol/L)的3.2倍，而化合物3b(IC50:1.62μmol/L)的抗H4IIE细胞活性则是索拉非尼(3.45μmol/L)的2.1倍[10]。作用机制研究结果表明，杂合体3a可阻滞H4IIE细胞的S期，进而发挥抗肿瘤活性。

香豆素-查耳酮杂合体4可通过与肿瘤细胞DNA的小沟结合解链DNA，导致肿瘤细胞死亡[11]。在移植人宫颈癌细胞的小鼠模型中，该杂合体不仅可显著减小肿瘤体积，活性与阿霉素相当，而且未见明显的毒副作用，小鼠的存活率与阿霉素相当。显然，该杂合体极具进一步研究价值。

3 香豆素-唑杂合体

香豆素-1,2,3-三氮唑杂合体5a～c(图3,IC50:0.13～6.25μmol/L)具有潜在的抗PC3,MGC803和HepG2肿瘤细胞活性，其中，代表物5c(IC50:0.43,0.13和1.74μmol/L)的活性优于对照药秋水仙碱(IC50:0.59,0.27和4.60μmol/L)[12]。作用机制研究结果表明，杂合体5c不仅可通过与秋水仙碱位点结合抑制微管蛋白聚合，而且可抑制细胞集落形成，阻滞G2/M期，诱导MGC803细胞凋亡。香豆素-噻唑-1,2,4-三氮唑-3-酮杂合体6(IC50:160～1120nmol/L)具有优秀的抗A549、MDA-MBA-231、HeLa和K562肿瘤细胞活性，且SAR显示，向R1和R2位引入供电子基尤其是甲氧基对活性有利，而卤素对活性不利[13]。代表物6a(IC50:160～310nmol/L)对所测4株肿瘤细胞的活性是对照药阿霉素(IC50:540～600nmol/L)的1.9～3.3倍，可作为先导物进一步研究。

香豆素-吡唑杂合体7(IC50:2.08～5.36μmol/L)的抗HepG2、SMMC-7721、U87和H1299肿瘤细胞活性与阿霉素(IC50:2.32～4.28μmol/L)相当，是5-氟尿嘧啶(IC50:31.7～45.3μmol/L)的7.8～18.1倍[14]。在移植SMMC-7721细胞的小鼠模型中，该杂合体在给药剂量为30和60mg/kg时可分别降低55.3%和68.3%的肿瘤质量，且在连续给药14d，给药剂量为300mg/kg时未见急性毒性和小鼠死亡，提示该杂合体安全性良好。基于此，该合体极具进一步研究价值。杂合体8 (IC50:0.36～2.56μmol/L)的抗HeLa、HepG2、F10和A549肿瘤细胞活性是对照药塞来考昔(IC50:7.79～15.64μmol/L)的6.1～21.6倍，且作用机制研究结果表明，该杂合体可显著地抑制肿瘤细胞黏附、迁移和侵袭，进而阻止肿瘤细胞转移[15-16]。

图2 香豆素-查耳酮杂合体1～4的化学结构

香豆素-吡唑啉杂合体9a～e(IC50:10～18nmol/L)的抗HepG2细胞活性是阿霉素(IC50:630nmol/L)的35～63倍，且SAR显示，向R2位引入噻吩-2-基比苯环对活性更有利[17]。进一步研究发现，在浓度为10nmol/L时，杂合体9f～i对源自白血病、肺癌、结肠癌、中枢神经系统、黑素瘤、卵巢癌、肾癌、前列腺癌和乳腺癌的60种人肿瘤细胞具有极为优秀的广谱活性，平均抑制率为77.59%～98.35%[18-20]。显然，这类杂合体值得进一步研究。

图3 香豆素-唑杂合体5～21的化学结构

香豆素-噻唑杂合体10(IC50:11.4～15.6μmol/L)尽管仅具有中等强度的体外抗EAC和DLA肿瘤细胞活性，但该化合物(75mg/kg,腹腔注射)在小鼠体内可抑制76%的肿瘤细胞生长，且可将小鼠的存活时间由11d延长到34d[21]。杂合体11(IC50:9.1～568.9 nmol/L)的抗HeLa细胞活性优于阿霉素(IC50:1107 nmol/L)，且SAR显示乙酯远优于甲酯[22]。作用机制研究结果表明，这类杂合体可激活半胱天冬酶-3和-9，阻滞肿瘤细胞的G0/G1期，诱导肿瘤细胞凋亡。香豆素-吡唑啉-噻唑杂合体12a～c不仅抗MCF-7细胞活性(IC50:5.41～6.56μmol/L)略优于阿霉素(IC50:6.73μmol/L)，而且对正常HFB4细胞的毒性(IC50:113～128μmol/L)与阿霉素(IC50:163μmol/L)相当[23]。三者(IC50:34～582nmol/L)对血管内皮生长因子受体2 (VEGFR-2)具有良好的抑制活性，但略弱于索拉非尼(IC50:19 nmol/L)。代表物12c可激活MCF-7细胞半胱天冬酶-7和-9，阻滞G2/M期，诱导MCF-7细胞凋亡。香豆素-吡唑-噻唑杂合体13(IC50:3.06～3.74μmol/L)的抗HepG2细胞活性与对照药阿霉素(IC50:3.01μmol/L)相当，可作为先导物进一步优化[24]。

香豆素-噻唑杂合体14a,b(IC50:1.29～1.96μmol/L)的体外抗HeLa和COS-7肿瘤细胞活性优于对照药阿霉素(IC50:2.05和3.04μmol/L)[25]。在EAC移植小鼠模型中，二者(39.3和45.5d)与安慰剂组(14.5d)相比可显著地延长小鼠的寿命，但略弱于5-氟尿嘧啶(49.0d)。此外，杂合体14b还可显著地降低小鼠体内肿瘤细胞数目和肿瘤体积，值得深入研究。杂合体15(IC50:3.48μmol/L)的抗Caco-2细胞和16(IC50:5.03μmol/L)的HepG2细胞活性与阿霉素(IC50:4.10和5.43 μmol/L)相当，且二者可提高半胱天冬酶-3和Bax表达，降低Bcl-2表达，进而诱导肿瘤细胞凋亡[26]。

香豆素-苯并噻唑杂合体17(IC50:240和330nmol/L)具有极高的抗SNB-75和OVCAR-4肿瘤细胞活性，可作为先导物进一步研究[27]。香豆素-苯并噻唑钌络合物18(IC50:0.30～68.69μmol/L)不仅具有抗NCI-H460,T-24,SKOV-3,MGC80-3和A549肿瘤细胞活性，而且对正常HL-7702细胞未显示出任何毒性(IC50:＞100μmol/L)[28]。在NCI-H460抑制的小鼠模型中，该络合物18(10.0mg/kg)可抑制61.3%的肿瘤细胞，活性优于顺铂(抑制率:25.5%)。不仅如此，该络合物未显示出明显的体内毒性，故可作为先导物进一步研究。香豆素-噻唑-2,4-二酮杂合体19(IC50:0.95～3.20μmol/L)的抗MCF-7,HeLa和A549肿瘤细胞活性与阿霉素(IC50:0.82～2.13μmol/L)相当，值得进一步优化[29]。

香豆素-苯并咪唑杂合体20 a～d(GI50:0.07～3.57μmol/L)具有广谱抗AGS、KATO-III、SNU-1、SKOV3、OVCAR-8、BXPC-3、PANC-1、T24、WiDr、HepG2、SN12C和K562肿瘤细胞活性，且代表物20a(GI50:70～410nmol/L)的GI50在纳摩尔级[30]。作用机制研究结果表明，杂合体20a可通过抑制PI3K-Akt-mTOR信号通路诱导肿瘤细胞凋亡。进一步研究发现，杂合体20e(GI50:50～80nmol/L)的抗MCF-7,NCI-H460和SF-268肿瘤细胞活性是对照药阿霉素 (GI50:40～90nmol/L)的1.5～2.0倍，值得进一步研究[31-32]。

香豆素-异噁唑啉杂合体21(IC50:10.5μmol/L)虽然仅具有中等强度的抗UACC 903细胞活性，但对正常FF2441细胞未显示出任何毒性(IC50:＞100μmol/L)[33]。在小鼠体内模型中，该杂合体不仅可在给药剂量为100mg/kg时减小85%的肿瘤体积，而且与对照组相比，可大幅延长小鼠寿命。

4 香豆素-吲哚/喹啉杂合体

香豆素-吲哚杂合体22 (图4,GI50:0.33～3.96μmol/L)和23(GI50:2.64～5.38μmol/L)对源自白血病、肺癌、结肠癌、中枢神经系统、黑素瘤、卵巢癌、肾癌、前列腺癌和乳腺癌的60种人肿瘤细胞具有优秀的广谱活性，可作为先导物进一步优化[34-35]。杂合体24a,b(IC50:7.4和5.5μmol/L)和25(IC50:9.1μmol/L)具有潜在的抗MCF-7细胞活性，但弱于对照药长春新碱(IC50:0.3μmol/L)[36-37]。其中，杂合体24a(IC50:＞100μmol/L)不仅对正常VERO细胞未显示出任何毒性，而且可通过阻滞肿瘤细胞G2/M期诱导细胞凋亡。

香豆素-喹啉杂合体26(IC50:5.45～9.41μmol/L)的抗PANC-1,HepG2和CCRF肿瘤细胞活性与阿霉素(IC50:1.05～6.90μmol/L)处于同一级别，可作为先导物进一步优化[38]。作用机制研究结果表明，该杂合体可通过激活半胱天冬酶-3和-7，抑制肿瘤细胞代谢，诱导细胞凋亡。杂合体27a,b(IC50:42和102nmol/L)的不仅抗A2780肿瘤活性是阿霉素(IC50:6.1μmol/L)的145.2和59.8倍，而且对正常PC12细胞无毒(IC50:＞100μmol/L)[39]。作用机制研究结果表明，该杂合体可激活半胱天冬酶-3和-9，提升Bcl-2和凋亡抑制蛋白survivin表达水平，促使ROS生成，进而导致 A2780细胞凋亡。

图4 香豆素-吲哚/喹啉杂合体22～28的化学结构

香豆素-喹啉铂络合物28(IC50:0.10～75.25μmol/L)对药敏型A549、SK-OV-3、HeLa、NCI-H460和耐顺铂型A549/DDP、SK-OV-3/DDP肿瘤细胞均敏感，且耐药性指数＜1，提示这类化合物具有治疗耐药肿瘤的潜力[40]。在HeLa抑制小鼠模型中，该络合物(2日,2.0 mg/kg)可抑制37.2%的肿瘤生长，活性优于顺铂(2日,2.0mg/kg,抑制率为35.2%)。不仅如此，络合物28组未见小鼠死亡或体重降低，表明其体内安全性良好。显然，该化合物极具进一步研究价值。

5 香豆素-氧化呋咱杂合体

香豆素-氧化呋咱杂合体29(图5)具有极为优秀的抗药敏型(HeLa、SKOV3、A549、OVCA429,OVCA433、A2780、MDA-MB-231、MCF-7、KB,MV-4-11和MM-1S)和耐药型(耐顺铂A2780/CDDP,耐吉西他滨MDA-MB-231/Gem,耐阿霉素MCF-7/ADR和耐长春新碱KB-V)肿瘤细胞活性，IC50分别为20.9～445nmol/L和24.9～156.8nmol/L[41-42]。作用机制研究结果表明，杂合体29可干扰MEK1和ERK1磷酸化，阻滞A2780细胞G2/M期，进而导致肿瘤细胞凋亡。在A2780移植小鼠模型中，与对照组相比，该杂合体在给药剂量为15和30mg/kg时可抑制55.8%和65.5%的肿瘤生长，且未见小鼠体重减轻。对药敏型和耐药型肿瘤细胞优秀的体内外活性加之良好的安全性，使得该杂合体极具进一步研究价值。

进一步修饰所得的杂合体30 (IC50:0.8～4542nmol/L和5.1～94.0nmol/L)和31(IC50:0.5～2182nmol/L和10.1～93.0nmol/L)对所测药敏型(HeLa、SKOV3、A549、OVCA429、OVCA433、A2780、MDA-MB-231、MCF-7、KB、MV-4-11和MM-1S)和耐药型(耐顺铂A2780/CDDP,耐吉西他滨MDA-MB-231/Gem,耐阿霉素MCF-7/ADR和耐长春新碱KB-V)肿瘤细胞也具有极为优秀的活性[43-44]。其中，代表物30a对所测肿瘤细胞的IC50更是低至0.5～143nmol/L，值得进一步研究。

6 其它香豆素杂合体

香豆素-吡啶杂合体32 a～c(图6,IC50:1.11～9.33μmol/L)的抗MCF-7、HCT-116、HepG2和A549肿瘤细胞活性与5-氟尿嘧啶(IC50:7.65～8.78μmol/L)相当或更优[45]。作用机制研究结果表明，此类杂合体可阻滞肿瘤细胞的G2/M期，诱导肿瘤细胞凋亡。杂合体33(IC50:1.66～9.27μmol/L)具有潜在的抗K562、HeLa、A549和MCF-7肿瘤细胞活性，且这类化合物可通过磷酸化Akt诱导细胞凋亡。代表物33a(IC50:1.66～7.86μmol/L)的活性与对照药BENC-511(IC50:0.95～6.43μmol/L)相当，但远弱于紫杉醇(IC50:0.0033～0.014μmol/L)[46]。

图5 香豆素-氧化呋咱杂合体29～31的化学结构

图6 香豆素杂合体32～36的化学结构

杂合体34(IC50:5.92～7.45μmol/L)具有潜在的抗HepG2,SK-Hep1和MCF-7肿瘤细胞活性，且抗SKHep1和MCF-7肿瘤细胞活性与顺铂相当[47]。作用机制研究结果表明，该杂合体可抑制HepG2细胞集落形成、侵入和转移，提高ROS水平，阻滞G2/M期，诱导肿瘤细胞凋亡。

杂合体35(IC50:2.53 μmol/L)不仅抗MCF-7细胞活性是对照药甲氨蝶呤(IC50:27.09μmol/L)的10.7倍，而且对正常BHK细胞的毒性极低(IC50:149.88μmol/L)，选择性指数为59.2[48]。杂合体36(IC50:4.63～7.02μmol/L)也具有潜在的抗A549、HepG2、PANC-1和SGC-7901肿瘤细胞活性，可作为先导物进一步优化[49]。

7 结束语

香豆素杂合体可通过多种作用机制发挥抗肿瘤活性，对包括耐药肿瘤细胞在内的多种肿瘤细胞具有良好的抑制活性。多个香豆素杂合体的体外抗肿瘤活性在纳摩尔级，体内活性优于对照药，且无明显毒副作用。显然，这类化合物在抗肿瘤新药研发领域必将大有作为。

本文综述了近年来所发现的具有优秀体内外抗肿瘤活性的香豆素-查耳酮、香豆素-唑、香豆素-吲哚/喹啉和香豆素-氧化呋咱等杂合体的最新研究进展，并总结了SAR和作用机制，为进一步研究提供理论支持。