呼吸病区碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌的分子流行病学分析

姚欣，黎彧利

(重庆市巴南区人民医院检验科，重庆 401320)

鲍曼不动杆菌是医院内感染的常见病原菌，常引起包括肺炎、败血症、尿路感染，伤口感染等多种医院内的感染。随着抗生素的广泛使用，众多文献报道耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌的出现，给临床抗感染治疗带来挑战[1]。往往分离到耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌的患者病情都较重，或在医院内住院时间较长，其分泌物、排泄物等可能成为污染源，如果医护人员和病房消毒不彻底，极有可能通过医护人员的手、医疗器械、围帘等在院内传播[2]。该研究通过对呼吸病区病人标本、医护人员手和护理单元围帘分离到的耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌进行分子分型，研究其相关性和传播途径，为防止耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌在院内传播提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

鲍曼不动杆菌分离自2017年7月—12月非重复株(同一患者只留取初次分离株)，全部菌株使用BDphoenix100全自动微生物鉴定药敏仪进行菌种鉴定。

质控菌株于2017年购于温州康泰生物科技有限公司，此次实验用到的质控菌株包括ATCC25922、ATCC27853。

1.2 抗菌药物敏感性试验

使用BDphoenix100全自动微生物鉴定药敏仪，MIC法测定10种抗菌药物的敏感性。根据美国CLSI2017年标准进行药敏判读，把其中分离于呼吸病区分离的碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌作为本研究的实验菌株。

1.3 随机引物多态性DNA(RAPD)分型

DNA制备：收集纯培养菌落于Ep离心管，加入200ng/mL蛋白酶K200μL，充分混匀后37℃4小时，加入Chelex-100 40mL，15000r/min离心30s，取上清液作为扩增模版液。RAPD扩增总体积为25μL，包括4种dNTPs各200μmol/L，TaqDNA聚合酶0.5U，DNA模版0.5ng/μL，随机引物(序列5'-TTATGTAAAACGACGGCCAGT-3')1.25μmol/L。PCR条件：94℃变性4min，94℃变性45s，36℃复性45s，72℃延伸2min，共40个循环，再72℃延伸5min。取扩增产物10μL以1.2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外凝胶电泳仪观察并拍照记录结果。

1.4 耐药基因检测

用PCR方法检测blaTEM、blaVIM、IMP-1、IMP-2、OXA-23、OXA-24、Int1、Int2酶的编码基因，各基因的扩增引物见表1。

2 结果

2.1 23株碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌对常用抗菌药物药敏情况

23株鲍曼不动杆菌对哌拉西林、哌拉西林/三唑巴坦、氨苄西林/舒巴坦、头孢他啶、头孢噻肟、头孢吡肟、庆大霉素、阿米卡星、四环素、亚胺培南、美罗培南，除阿米卡星和黏菌素外其他抗菌药物耐药率均较高，12种抗菌药物药敏情况见表2。

2.2 随机引物多态性DNA(RAPD)分型结果

随机引物多态性DNA(RAPD)分型表明23株鲍曼不动杆菌中有1株细菌(5号菌株，图1)不是同一克隆，其余细菌均来源于同一克隆株。17株病人标本来源鲍曼不动杆菌分布在呼吸科不同病房，经医院感染科2017年7—12月采样，医护人员手和病房围帘分别检出1株和3株鲍曼不动杆菌，且与18株病人标本检出鲍曼不动杆菌有同源性，从而推断呼吸科碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌的爆发与医护人员手卫生和围帘均有相关性。

2.3 耐药基因检测结果

表1 靶基因PCR引物序列

23株鲍曼不动杆菌中blaTEM、OXA-23、整合酶Int1的阳性率分别为95.7%、69.5%及82.6%，结果见表3。

3 讨论

鲍曼不动杆菌是引起肺炎、重症病人感染的重要病原菌，也是医院感染的常见病原菌，医院病人标本分离株常呈多重耐药，且碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌越来越多见[3]。耐药菌可以在特定的环境中引起传播和流行，以致感染的发病率和病死率日益增加[4]。

碳青霉烯类抗生素是目前临床抗菌活性最强大的抗生素之一。随着该药的广泛使用，已出现碳青霉烯类耐药的鲍曼不动杆菌，导致感染流行成为全球关注的公共卫生问题。本研究分析23株碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌对常用抗生素的耐药情况表明：氨苄西林、哌拉西林、头孢唑林、氯霉素、氨曲南、头孢他啶、庆大霉素、四环素、头孢噻肟、头孢吡肟、阿莫西林/克拉维酸、美罗培南12种抗生素耐药率为100%，氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林/三唑巴坦、复方磺胺甲噁唑、左氧氟沙星、环丙沙星、亚胺培南耐药率＞90%，阿米卡星耐药率也高达76.3%，仅有黏菌素敏感率为100%。黏菌素作为近年来的新型抗生素还保持着对碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌的治疗活性，作为治疗碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌的最后防线。

表2 23株鲍曼不动杆菌对抗菌药物敏感性

图1 RAPD结果显示5号与其他不同

表3 23株碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌耐药基因检测结果

通过对23株碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌随机引物多态性对其同源性分析发现：除一株来源于患者痰培养分离株外，其余22株为同一克隆株，其中有1株来源于医护人员手，3株来源于病房围帘，这表明碳氢霉烯类耐药鲍曼不动杆菌在2017年7月—12月期间在我院呼吸科流行，很有可能与医护人员手卫生以及病房环境相关，不排除还存在其他病房环境因素的风险可能。

文献报道，鲍曼不动杆菌产生不同类型的β-内酰胺酶成为β-内酰胺类抗生素耐药的主要原因，国内从多重耐药鲍曼不动杆菌中发现了多种β-内酰胺酶，最主要是质粒介导的超广谱β-内胺酶(ESBLs)。本研究从23株碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌检测blaTEM、blaVIM，结果blaTEM阳性率高达95.7%，鲍曼不动杆菌产超广谱β-内胺酶合并外膜蛋白缺失、PBPs改变或主动外排机制，可能是鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类耐药严重的原因。

鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制最主要是产生碳青霉烯酶。不动杆菌中发现的碳青霉烯酶主要为B类金属酶和D类苯唑西林酶。B类金属酶，常见有blaIMP和blaVIM型β-内酰胺酶；D类苯唑西林酶为OXA类酶。本研究23株碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌金属酶IMP-1阳性率为26.1%(6/23)，OXA-23阳性率为69.5%(16/23)。可以看出我院鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类耐药主要机制也是产D类苯唑西林酶，OXA-23可存在于质粒或染色体上，通过可移动元件如转座子或质粒在不同菌株、不同个体之间传播[5-6]，与国内报道流行基因型为OXA-23一致[7]。

整合子是一个新的细菌耐药基因水平传播单元，是细菌获得性耐药的重要途径，它是存在于质粒和(或)染色体上的具有基因捕获和表达功能的遗传单位，介导耐药基因水平传播和转移[8]。研究报道，整合子阳性的鲍曼不动杆菌对临床常用抗菌药物的总体耐药率高达90%左右，而整合子阴性鲍曼不动杆菌的总体耐药率仅为60%[9]。IntI1、IntI2、IntI3类整合酶是多重耐药整合子。本研究中整合酶Int1阳性率高达82.6%(19/23)，说明我院多重耐药鲍曼不动杆菌主要以I类整合子为主。

本研究显示，我院碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌主要携带TEM广谱β-内酰胺酶基因、产IMP-1金属酶和OXA-23型碳青霉烯酶、I类整合子，产生OXA-23型碳青霉烯酶是主要耐药机制。同期检出的鲍曼不动杆菌有1株来源于医护人员手，3株来源于病房围帘，说明环境因素很可能与病人间鲍曼不动杆菌的流行相关[10]。有研究报道多重耐药鲍曼不动杆菌在环境、医务人员和患者之间传播，我国也有发现同一克隆株的感染暴发[12-13]。有研究认为，优势克隆株在医院的持续存在可能与该地区抗生素压力有关，全基因组和比较基因组发现，即使属于同一克隆，其质粒、耐药岛等基因结构也呈多变性，可能与不同压力环境下活跃的基因组有关[15]。所以持续对同一地区的同一克隆株进行监测，有助于了解其变化趋势。

4 结论

加强医护人员手卫生是遏制医院感染蔓延的有效途径，特别是检出多重耐药菌感染或携带的患者床旁必须放置手消毒剂，加强手依从性监督[11,14]。病房围帘应定期清洗消毒后使用，同时提示病房床单、窗帘、床栏以及呼吸机、监护仪等的清洁消毒与监测都要定期完成，尽量减少医院感染的发生，减少院内微生物传播的风险，特别是呼吸病区、重症监护室等易感区域。