藏菖蒲挥发油对多房棘球蚴的体外杀伤活性※

李占强，李润乐，苏姗姗，芦殿香，汤 锋*，樊海宁

[1.青海大学高原医学研究中心，高原医学教育部重点实验室， 青海省高原医学应用基础重点实验室(青海-犹他高原医学联合重点实验室)，青海 西宁 810001； 2.西宁海关技术中心，青海省食品安全研究重点实验室，青海 西宁 810003； 3.青海大学附属医院肝胆胰外科，青海省包虫病重点实验室，青海 西宁 810001]

本研究以藏菖蒲AcoruscalamusL.挥发油为研究对象，明确其对体外多房棘球蚴的杀伤活性。

1.材料、仪器与方法

1.1 材料、仪器

藏菖蒲饮片(AcoruscalamusL.，购自青海中藏药材市场)，阿苯达唑(TCI，纯度>98%)。胎牛血清(BI公司)，DMEM培养基(Gibico公司)。激光共聚焦显微镜(Carl Zeiss Jena公司，LSM 800)，光学显微镜(Carl Zeiss Jena公司，Axio Vert.A1)，培养箱(Thermo公司，BB15)。

1.2 方法

1.2.1 药物提取

称取50 g藏菖蒲饮片剪碎置500 mL烧瓶中，加水浸泡(过夜)后，采用水蒸气蒸馏法蒸馏6 h，收集无色挥发油2.6 mL。经无水Na2SO4干燥后的挥发油用DMEM培养基分别配制10.00、1.25 mg/mL浓度的藏菖蒲挥发油溶液。

1.2.2 原头蚴的分离及体外培养

原头蚴的分离及体外培养参考文献方法[1]。

1.2.3 挥发油体外活性的检测

在激光共聚焦培养皿中，依次加入1 000个原头蚴、2 mL待测挥发油溶液(10mg/mL)后置活细胞工作站(37℃，5%CO2)进行培养，并动态观察原头蚴存活情况。

在六孔板中，分别取2 mL待测挥发油溶液(1.25mg/mL)、对照药物阿苯达唑溶液(10mg/mL)和PBS溶液与原头蚴(1000个)在培养箱中一块培养。培养5 h后，加入等体积伊红溶液混合染色，吸取10 μL混合液，于光学显微镜下计数原头蚴总个数和死亡个数(虫体红色且无活动性视为死亡[1])。

1.2.4 挥发油对原头蚴形态的影响

将经挥发油(10mg/mL)处理的原头蚴用3%戊二醛固定15 h后，用PBS溶液清洗3次，再用1%锇酸固定1 h后通过扫描电镜观察原头蚴整体形态。

1.2.5 统计学处理

2.结果

2.1 藏菖蒲挥发油对多房棘球蚴活力的影响

将原头蚴放入藏菖蒲挥发油稀释液(10mg/mL)共培养并实时观察发现，共培养起始阶段，原头蚴均处于活跃状态，头节外翻，整体形态完整、清晰，随着共培养时间的增加，原头蚴运动开始减缓，活力下降，15 min后，部分原头蚴整体形态发生显著变化，趋向于球体形态且主要特征模糊，运动性也开始减弱并消失，透光性降低(图1箭头所示)。空白对照组中的原头蚴均处于活跃状态，头节均外翻，原头蚴整体形态完整、清晰。药物作用前与作用15 min后情况如图1所示。

ACE：藏菖蒲挥发油(10mg/mL)；PBS：对照品

2.2 藏菖蒲挥发油对多房棘球蚴的体外杀伤活性

将PBS溶液(空白对照组)、藏菖蒲挥发油(1.25mg/mL)、阿苯达唑(10mg/mL)与原头蚴共培养5 h后，经伊红染色后在光镜下观察发现：空白对照组中的原头蚴没有被伊红染色，有一定活动性，如图2A所示；1.25 mg/mL藏菖蒲挥发油组中的原头蚴大部分被伊红染色，运动性消失，如图2B所示；10 mg /mL阿苯达唑组中的原头蚴未被伊红染色，具有一定活动性，如图2C所示。镜下统计原头蚴总个数和死亡个数：空白对照组、藏菖蒲挥发油(1.25mg/mL)组、阿苯达唑(10mg/mL)组死亡率分别为(1.8±0.6)%、(94.1±2.1)%、(10.9±2.4)%。挥发油组同空白组和阿苯达唑组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)，如图2所示。

A：PBS缓冲液；B：藏菖蒲挥发油(1.25mg/mL)；C：阿苯达唑(10mg/mL)；★：P<0.05

2.3 藏菖蒲挥发油对原头蚴形态的影响

多房棘球蚴经藏菖蒲挥发油(10mg/mL)作用后的扫描电镜显示，正常对照组原头蚴形态饱满，光滑完整，体表微绒毛丰富，如图3A所示。经藏菖蒲挥发油作用后，形态变化显著：原头蚴整体形态皱缩，体表凹凸不平，体表微绒毛消失，头部钩脱落，如图3B所示。

A：PBS缓冲液；B：藏菖蒲挥发油(10mg/mL)

3.讨论

本研究结果表明，藏菖蒲挥发油对多房棘球蚴具有较强的杀伤活性。

在高浓度藏菖蒲挥发油(10mg/mL)作用下，短时间内可造成原头蚴活力下降，在低浓度(1.25mg/mL)条件下经长时间作用可引起较强的致死作用，致死率远高于10 mg/mL的阿苯达唑药物[2]。但藏菖蒲挥发油的体内活性有待考察。

藏菖蒲挥发油对原头蚴形态的影响同烈香杜鹃挥发油相比，二者都可造成原头蚴体表微绒毛消失、体表凹凸不平、头部钩脱落等，但藏菖蒲挥发油还可造成原头蚴整体形态皱缩，有别于烈香杜鹃挥发油，提示其作用机制不一致，主要原因在于二者化学成分不同[1]。

藏菖蒲化学成分主要包括挥发油(单萜、倍半萜、苯丙素)、三萜、木脂素、黄酮等。目前，已在藏菖蒲挥发油中鉴定出了近百种化学成分，包括萜类、芳香类物质等。而芳香类物质主要为细辛醚类成分，包括α-细辛醚、β-细辛醚和γ-细辛醚，其含量因植物变种类型及产地不同而差异悬殊，如在A.calamusvar.angustata中，β-细辛醚含量占80%，而在A.calamusvar.americanus中未发现β-细辛醚[3]。

课题组对所用的AcoruscalamusL.挥发油进行了GC-MS分析，发现主要成分为α-细辛醚和异丁香酚甲醚，相对含量分别为43.49%、18.43%，占总挥发油的61.92%，而β-细辛醚相对含量较低。此外，还有甲基丁香酚、异甲基丁香酚、γ-细辛醚等芳香类物质。郑佳等人对α-细辛醚与β-细辛醚体外杀伤多房棘球蚴的活性研究显示，β-细辛醚对多房棘球蚴具有明显杀伤作用，而α-细辛醚在5 mg/mL浓度下未表现出杀伤作用[4]。此外，有研究表明，α-细辛醚具有致肝细胞癌和致突变等毒性作用[3，5，6]。由此推断，藏菖蒲挥发油对多房棘球蚴的体外杀伤活性物质并不是其主成分—α-细辛醚，综合之前相关报道，对多房棘球蚴具有显著的杀伤作用的丁香酚、β-细辛醚都具有“C6-C3”的母核结构，主要区别在于丙烯基中双键的位置及构型、甲氧基和羟基的取代数量和位置，文献中已明确丙烯基中的1-2位为双键时，顺式结构有活性[4，7]。因此，藏菖蒲挥发油中的丁香酚、甲基丁香酚、γ-细辛醚类物质可能为藏菖蒲挥发油的活性成分，但异丁香酚及其衍生物是否有活性尚待明确。故有必要对具有“C6-C3”母核物质的构效关系进行深入研究，明确其必需活性基团，为后续安全、有效的药物研究奠定基础。此外，藏菖蒲挥发油中的萜类物质是否具有杀伤活性亦需明确。