牦牛和藏羊肺表面活性物质磷脂的组成和含量※

徐 波，李永晓，安志芳，王志洁，李吉梅，高聪慧，魏 莲，魏登邦*

(1.青海大学生态环境工程学院；2.省部共建三江源生态与高原农牧业国家重点实验室，西宁 810016)

牦牛(Bosgrunniens)和藏羊(Ovisaries)尽管生活在高海拔低氧环境中，但它们的动脉氧分压和血氧饱和度显著高于黄牛和绵羊，静脉氧分压和血氧饱和度显著低于黄牛和绵羊[1-3]，说明牦牛和藏羊不仅能够从低氧环境中有效获取氧，而且其组织能够有效利用氧。氧的有效利用与肺组织气体交换的总面积大小有关，是否与肺表面活性物质磷脂的组成和含量密切相关尚不明确。本研究拟通过分析牦牛和藏羊PS的组分和含量特征，进一步探讨它们适应低氧环境的生理机制。

1.材料与方法

1.1 实验动物选择

选择青海海北刚察地区(海拔3200m，当地氧分压为14.31Kpa，含氧量为198g/m3)的牦牛和藏羊各10只。动物处理按照国家《实验动物管理条例(GB14923-2010)》执行。

1.2 肺表面活性物质的制备

实验动物宰杀完毕后直接取出肺组织样品并称重。肺组织按照每克肺2 mL的标准分3次缓慢注入37 ℃生理盐水，充分灌洗肺泡后抽出灌洗液。将灌洗液离心(4℃，10000r/min)10 min，取上清液置-50 ℃真空冷冻干燥机干燥(GLZY-0.5B，上海浦东冷冻干燥设备有限公司)。将冻干粉置-20 ℃冰箱冻存。

1.3 肺表面活性物质中脂质成分的提取

1.4 磷脂分析方法的建立

1.4.1 标准品储备液的配置

1.4.2 样品检测

1.4.3 精密度、重现性和稳定性实验

取LPPC、DPPC、PG、PSe和PI的磷脂混合标准品溶液分6次进样分析，每次进样15 μL，计算各磷脂峰面积的相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)，为日内精密度实验；次日再取此溶液用相同方法进样分析，将12次进样分析的峰面积合并计算，为日间精密度实验。取同一样品溶液六份，分别进样，计算各磷脂成分的峰面积和保留时间的RSD，为重现性实验。取同一样品溶液六份，在0、2、4、6、8、1、12 h分别进样测定各磷脂成分峰面积的RSD，为稳定性实验。

1.5 统计学处理

2.结果

2.1 磷脂检测方法的精密度、重现性和稳定性

在本实验选定的色谱条件下，5种单一标准品峰型良好，混合标准品能实现基线分离。LPPC、DPPC、PSe、PG、PI的出峰时间分别在2.6、4.1、5.0、7.9 min、9.3 min(图1)。标准品进样量与峰面积的关系计算出线性回归方程(表1)，说明各磷脂标准品在各自范围内的含量与峰面积线性关系良好。LPPC、DPPC、PSe、PG、PI的日内精密度RSD值分别为0.39%、0.81%、0.21%、0.58%、0.44%；日间精密度RSD值为0.83%、1.24%、0.48%、0.76%、0.69%，说明该仪器分析的精密度良好。单一标准品溶液LPPC、DPPC、PSe、PG、PI的峰面积的RSD分别为0.43%、1.08%、0.73%、0.37%、0.25%，保留时间的RSD分别为0.12%、0.45%、0.16%、0.08%、0.86%，说明该方法重现性良好。在0、2、4、6、8、10、12 h分别进样测定，测得LPPC、DPPC、PSe、PG、PI峰面积的RSD分别为0.88%、0.38%、0.23%、0.45%、0.62%，说明该方法稳定性良好。

A、B、C、D、E、F分别为LPPC、DPPC、PSe、PG、PI的单一标准品和混合标准品的HPLC色谱图

表1 五种磷脂峰面积与含量的线性回归方程

2.2 牦牛和藏羊肺表面活性物质中磷脂的成分和含量

牦牛和藏羊PS中均含有LPPC、DPPC、PSe、PG、PI ，但相对含量存在明显差异(图2 A、B)。统计结果表明，牦牛和藏羊PS中磷脂总含量分别为180.90±14.80、184.53±9.58 μg/mL ，无显著性差异(P>0.05)(图2 C)。牦牛PS中LPPC的含量和相对含量均极显著高于藏羊(P<0.01)，但DPPC、PSe、PG和PI的总含量和相对含量均极显著低于藏羊(P<0.01)(表2、3)。

A和B分别表示牦牛和藏羊PS中磷脂成分的HPLC色谱图；C表示牦牛和藏羊PS中的磷脂总含量

表2 牦牛和藏羊肺表面活性物质中磷脂的含量

表3 牦牛和藏羊肺表面活性物质磷脂的相对百分含量

2.3 牦牛和藏羊肺表面活性物质中PC、LPPC、DPPC的含量

牦牛和藏羊PS中PC总含量分别为(163.84±11.83)μg/mL、(134.49±5.42)μg/mL，分别占其PS中总磷脂含量的(90.57±6.54)%和(72.88±6.94)%。牦牛PS中PC的总含量和相对含量均极显著高于藏羊(P<0.01)(表4)。牦牛PC中LPPC的总含量极显著高于藏羊，但DPPC总含量极显著低于藏羊(P<0.01)(表4)。牦牛和藏羊LPPC含量占PC总含量的百分比分别为(44.71±3.66)%、(31.12±2.98)%；DPPC含量占PC总含量的百分比分别为(68.88±4.88)%、(55.29±0.96)%；牦牛PC中LPPC占PC的相对含量极显著高于藏羊，但DPPC占PC的相对含量极显著低于藏羊(P<0.01)(表4)。

表4 牦牛和藏羊PS中PC、LPPC、DPPC成分含量

3.讨论

PS是哺乳动物肺组织中的重要组分，大量研究表明，肺表面活性物质磷脂成分能够减小肺泡表面张力，维持肺泡正常结构，从而维持肺的顺应性和稳定性，保证哺乳动物的正常呼吸功能[4，5]。PS磷脂成分中的PC是降低肺泡表面张力的主要物质，其中DPPC是肺泡腔表面磷脂单分子膜的主要成分，PG虽然含量低，但是能够促进DPPC迅速展开和吸附，缺乏PC和PG会导致肺泡表面张力升高、肺的顺应性下降[6]。我们的研究结果显示，牦牛肺表面活性物质磷脂中，PC百分含量为90%左右，平原黄牛为79%左右；藏羊肺表面活性物质磷脂中，PC百分含量为72%左右，平原绵羊为58%左右。两种高原动物肺表面活性物质磷脂中PC占比明显高于它们的平原近缘物种。不同物种中，肺表面活性物质中磷脂各成分的百分比均有所差异[7-9]。同为高原低氧环境中生存的牦牛和藏羊，磷脂成分同样具有显著差异，但是两种动物具有都有相对高含量PC和PSe的趋同特征，这可能是长期适应低氧环境的结果。

大量临床研究表明，哺乳动物PS中磷脂成分比例失调是各种呼吸系统疾病最重要的生理特征，新生儿呼吸窘迫综合征(Neonatal respiratory distress syndrome，NRDS)、胎粪吸入终合征(Meconium aspiration syndrome，MAS)和急性肺损伤(Acute lung injury，ALI)、慢性梗阻性疾病(哮喘、囊性纤维化、慢性支气管炎等)、肺炎等均存在比例失调问题[10-14]。

研究表明，RDS和MAS占新生儿死亡原因的30%，占早产儿死亡原因的50%～60%[15]。在NRDS、MAS、ALI和肺炎患者的肺泡灌洗液中，PC和PG含量显著降低，同时患者的动脉氧分压和氧饱和度显著降低，二氧化碳分压显著增高[16-18]。对上述患者应用外源性PS制剂治疗后，患者肺组织中PS相对含量恢复正常，DPPC和PG相对含量显著增高，动脉血氧分压和动脉血氧饱和度显著升高，动脉血二氧化碳分压显著降低，肺的顺应性明显改善[16-18]。在哮喘患者的肺泡灌洗液中，DPPC、PG、PSe、PI等成分含量均显著降低，肺顺应性降低，这与肺部血液渗漏和炎症反应加剧密切相关，同时患者肺动脉氧分压降低、二氧化碳分压上升、血氧饱和度降低[19，20]。在应用雾化吸入外源性PS制剂治疗之后，患者的肺泡各磷脂含量和动脉氧分压、血氧饱和度等血气指标均得到明显恢复[21，22]。因此，肺气体交换功能的维持与肺表面活性物质磷脂的含量和各磷脂成分的比例密切相关，肺表面活性物质磷脂含量的降低会导致肺气体交换功能受阻。以上结果提示，牦牛和藏羊在低氧环境中能维持血液中较高的氧分压和血氧饱和度，可能与其肺表面活性物质磷脂中高含PC有关。

综上所述，世居青藏高原的牦牛和藏羊的肺表面活性物质的磷脂组分的含量和比例发生了显著改变，这种磷脂含量的变化可能有利于增强肺泡气体交换功能。

致谢：感谢西北高原生物研究所李玉林、陈涛研究员和李洪梅同学对本研究的支持和帮助。