mTOR非依赖途径介导二甲双胍对类风湿关节炎大鼠心血管损伤的作用及机制*

李培霆， 刘俊， 周海燕， 李龙*， 曾家顺*

(贵州医科大学附属医院 风湿免疫科， 贵州 贵阳 550004)

类风湿关节炎(rheumatoid rthritis，RA)是一种常见的以关节受累为主的慢性全身性自身免疫病，除关节外，肺、心、神经系统等组织或器官也可受累，有较高的致残及致死率[1]。近年来，RA患者体内自身免疫介导的炎症会进一步导致血管内皮功能紊乱、氧化应激及高凝高血脂状态，直接或间接参与心血管疾病发生和发展，导致了动脉粥样硬化的发生和血管内皮功能障碍[2]；除此之外，糖皮质激素、非甾体抗炎药等治疗手段可增加动脉粥样硬化的风险[3]。因此，RA患者合并心血管损伤的发病率及死亡率较正常人明显增高[4]。磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K/Akt )信号途径分为依赖性和非依赖性，主要以哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)为交点[5]。在PI3K/Akt非依赖性途径中，发现激活状态的磷酸腺苷活化蛋白激酶(5′-adenosine monosphosphate-activated protein kinase，AMPK)信号通路，可抑制血管内皮细胞增殖及代谢，并促进血管内皮细胞凋亡[6]。二甲双胍(metformin，Met)在糖尿病及其并发症的作用研究较多[7]，但在RA中心血管损伤的调节研究较少，本实验通过对RA大鼠模型进行Met干预，观察其靶向AMPK信号通路对心血管损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1动物来源 清洁级健康雄性Wistar大鼠32只(购自本校动物实验中心)，体质量190～220 g，适应性饲养7 d。

1.1.2主要试剂及仪器 牛Ⅱ型胶原(10 mg/支，美国Chondrex公司)，弗氏不完全佐剂(5 mL/支，美国Sigma公司)，AMPK抑制剂Compound C(美国sigma公司)，0.1 mol/L冰乙酸(上海申博化工有限公司)，4%水合氯醛(天津福晨化学试剂厂)，Met(中美上海施贵宝制药有限公司)，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和mTOR抗体(武汉博士德生物工程有限公司)，AMPK(武汉三鹰生物有限公司)；炎症因子检测试剂盒和C6流式细胞仪(美国BD公司)，5424R离心机(美国Eppendorf公司)。

1.2 方法

1.2.1造模及分组 取8只大鼠作为正常对照组(Con组，生理盐水灌胃)，其余24只大鼠造模：将牛Ⅱ型胶原溶于0.1 mol/L冰醋酸中，制成质量浓度为 2 g/L溶液，与等量弗氏完全佐剂混合成稳定乳剂(0.1 g/L)注射于大鼠尾根部0.2 mL，第14天相同方法加强免疫；每隔3～5 d测量足背厚度及评估关节炎指数评分，其中关节炎指数评分定义如下[8]：踝关节正常为0分，踝关节出现红斑和轻微肿胀为1分，踝关节到跖趾关节或掌关节出现红斑或中度肿胀为3分，踝关节到趾关节出现红斑和重度肿胀为4分，四肢评分累计0～16分；大鼠出现2次反应且关节炎指数大于5分即造模成功。24只模型鼠随机均分为模型组(RA组，生理盐水灌胃)、Met治疗组[Met组，400 mg/(kg·d) Met灌胃]、联合治疗组[Met+CC组，400 mg/(kg·d) Met灌胃+AMPK抑制剂Compound C 20 mg/(kg·d)腹腔注射]，造模后第21天起开始干预，用生理盐水将盐酸Met充分溶解并摇匀，制成药水后分别对Met组、Met+CC组治疗5周，同时Met+CC组大鼠予以Compound C 20 mg/(kg·d)腹腔注射，总实验观察周期为8周。实验结束时，称重后麻醉各组大鼠，经腹主动脉采血，然后暴露大鼠胸腔，剪去两侧大部分肋骨及胸骨，取心脏及胸主动脉后予福尔马林固定，4%甲醛浸泡，制成组织切片，显微镜观察组织病理学变化。

1.2.2心脏及血管组织学观察 取同一部位心脏及血管组织，4%甲醛浸泡，病理切片、HE染色，光镜下观察心脏及血管组织学形态，并用IPWin32系统采集图像，由病理科医师对结果评估及分析。

1.2.3血清炎症因子γ干扰素(interferon-γ，IFN-γ)、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)及IL-17含量检测 实验结束时分别取各组大鼠全血2 mL，3 000 r/min离心15 min，取上清置于Ep管，按炎症因子检测试剂盒说明书操作程序，采用流式细胞仪检测各组大鼠血清IFN-γ、IL-6及IL-17的荧光强度。

1.2.4心脏及血管组织VEGF、mTOR及AMPK蛋白表达 采用PV-6000试剂盒检测组织抗原表达，包埋切片、脱蜡、水化、切片后孵育一抗(VEGF、AMPK及mTOR)及二抗(山羊抗兔IgG抗体-HRP多聚体)37 ℃孵育30 min，PBS冲洗；染色液显色至棕黄色终止反应，经光学显微镜观察阳性染色的强度，并用Image-pro Plus Version6.0 采集图像。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 大鼠一般状况

Con组大鼠精神状态可，毛发有光泽，行动自如。RA组大鼠逐渐关节红肿，进食、活动减少，精神萎靡，后期出现行走跛行、关节畸形。见图1。

图1 Con组与RA组大鼠不同时间前足的肉眼观Fig.1 Observation of forefoot in Con group and RA group in different time

2.2 心脏及血管组织学变化

Con组大鼠见心脏及血管的组织结构；RA组与Met+CC组大鼠病变相近，心肌细胞出现不同程度的变性、坏死，可见局灶性或弥漫性的炎性细胞浸润，血管内膜层呈现一定的肿胀并伴纤维排列紊乱，中层有不同程度变性如弹力组织网断裂、平滑肌玻璃样变性，外膜纤维化；Met组大鼠病变程度较RA组有所减轻。见图2。

图2 各组大鼠心脏及血管组织学变化(HE，×400)Fig.2 Results of cardiovascular tissues in each group(HE，×400)

2.3 血清INF-γ、IL-6及IL-17水平

RA组大鼠血清INF-γ、IL-6及IL-17水平高于Con组，差异有统计学意义(P<0.05)；Met组大鼠血清INF-γ、IL-6水平低于RA组和Met+CC组，差异有统计学意义(P<0.05)；采用AMPK抑制剂后，Met+CC组大鼠INF-γ、IL-6及IL-17含量与RA组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠的血清INF-γ、IL-6及IL-17水平Tab.1 Results of serum INF-γ,IL-6 and

2.4 心血管组织VEGF、AMPKa及mTOR的表达

与Con组比较，RA组大鼠心血管组织VEGF、mTOR表达水平升高，AMPK水平下降，差异有统计学意义(P<0.05)；与RA组、Met+CC组比较，Met组大鼠心血管组织VEGF水平降低，AMPK、mTOR升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；Met+CC 组与RA组比较差异无统计学意义(P>0.05)，提示上述变化受到AMPK抑制剂的拮抗。见表2和图3。

图3 各组大鼠心血管组织VEGF、AMPK及mTOR蛋白的表达(400×)Fig.3 Expression of VEGF,AMPK and mTOR protein in vascular tissue of rats in each group(400×)

表2 各组大鼠心血管组织通路相关蛋白的光密度值Tab.2 Optical density of cardiovascular tissue pathway related proteins in each

3 讨论

近年来，大量研究证实炎症因子微调控可以加速心血管损伤的进程[9]。本研究发现，RA组大鼠心血管组织HE染色中心肌细胞变性坏死、炎性细胞浸润及血管病变的程度多于Con组，血清炎症因

子INF-γ、IL-6及IL-17也较Con组升高(P<0.05)，提示RA处于持续炎症状态的同时存在早期心血管损伤。Met治疗后大鼠血清炎症因子INF-γ、IL-6降低表达减少(P<0.05)，提示Met可以减轻RA大鼠炎症反应。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是炎症存在的一种形式，有文献报道，腹腔注射LPS可引起大鼠心脏功能障碍和心脏毒性，其机制包括AMPK/mTOR激活介导的抑制自噬作用，AMPK的激活改善LPS诱导的大鼠心脏毒性及心肌自噬上调[10]。本研究结果显示RA组大鼠VEGF表达也较Con组升高，Met治疗后表达降低，差异具有统计学意义(P<0.05)，提示Met可以降低RA心血管组织VEGF表达。VEGF是内皮增殖、迁移的刺激剂，能直接促进心肌血管的新生，增加血管通透性作用[11]。有研究表明，Met可以通过抑制人内皮细胞增殖、迁移，从而达到抑制血管新生的作用[12]；Met作用于人脐静脉内皮细胞可抑制INF和IL-6[13]；Met在糖尿病合并心血管疾病中有明显的保护作用，其机制并非是控制血糖，而是降低炎症因子和抗氧化的作用[14-15]；在人冠状动脉粥样斑块标本中VEGF呈高度表达，影响斑块的稳定性，且新生血管形成可促进粥样斑块的病变及范围扩大[16]，因此Met可以抑制VEGF水平更有利于延缓斑块。本实验中，与Con组相比，RA组与Met+CC大鼠心血管组织AMPK表达降低(P<0.05)，通过Met治疗后AMPK蛋白、mTOR表达增加(P<0.05)，说明Met可以调控AMPK及mTOR表达，而Compound C抑制了这些作用(P<0.05)，提示AMPK通路可能参与这一过程。mTOR信号通路包括Akt/mTOR和AMPK/mTOR通路，AMPK是一种能量平衡的代谢传感器，细胞能量的增加和AMP/ATP比值的增加能促进AMPK的形成[17]。它通过磷酸化抑制mTOR进而诱导自噬[18-19]，AMPK活化能下调mTOR活性将细胞周期阻滞于G0/G1期，抑制细胞生长、增殖[20-21]。以往的研究证实Met是一种有效的AMPK激活剂，主要通过激活AMPK下调哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mammalian target of rapamycin complex1，mTORCl)表达，改变下游VEGF、Caspase3等水平，产生多种有益的效应[22]；Schneider等[23]证实了AMPK可以通过激活内质网钙泵和大量导钙通道来舒张阻力血管。可见，AMPK的激活在血管平滑肌亦可以产生保护血管的作用。然而，本实验中RA组大鼠存在AMPK激活时，mTOR磷酸化水平也随之升高，与AMPK/mTOR调控通路的机制存在矛盾，推测AMPK激活时，可能还受到依赖途径PI3K/Akt等其他信号调控mTOR表达。

综上所述，Met对RA早期心血管损伤有保护作用，可通过减轻RA炎症反应及提高AMPK水平进而调节VEGF表达，从而延缓RA心血管损伤的进展，且Met还可能通过其他途径影响mTOR表达。