基于能量循环再生系统酶法生产谷胱甘肽

张 星， 崔向伟， 李宗霖， 李志敏

（华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237）

谷胱甘肽（Glutathione，GSH）是由L-谷氨酸（LGlu）、L-半胱氨酸（L-Cys）和甘氨酸（Gly）通过肽键连接而成的活性巯基化合物。GSH 在生物体内具有抗氧化、保护细胞和解毒等功能[1]。作为药物、食品和化妆品添加剂，GSH 也广泛应用于医药和轻工领域[2-3]。目前，GSH 的生产方法主要包括化学法和生物法。生物法合成GSH 具有反应条件温和、成本低以及环境污染少等优点。生物法又可分为发酵法和酶法。发酵法生产GSH 存在着底物和产物降解，副产物竞争和下游分离困难等缺点，因而GSH 的生产效率不高[4]。相比于发酵法，酶法生产体系因为组分简单，底物与酶更易接触，具有周期短、易操作和得率高等优点[5]。

GSH 的生物合成途径是通过两步依赖腺苷三磷酸（ATP）的反应合成，首先，L-Glu 和L-Cys 由γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶催化，生成二肽γ-谷氨酰半胱氨酸，再经GSH 合成酶催化，在γ-谷氨酰半胱氨酸的C 端残基加上甘氨酸形成GSH[6]。谷胱甘肽双功能合成酶(GshF)是近年来发现的新型酶，在ATP 和Mg2+或Mn2+存在下，具有可以同时催化GSH 两步反应的活性[7-8]，这极大地推进了GSH 生物合成的研究进展。酶法生产GSH，一般需要在体系中直接添加价格昂贵的ATP，使得生产成本大大增加，限制了酶法生产的大规模应用。多聚磷酸激酶（PPK）是可以用于ATP 再生的一种激酶，利用底物多聚磷酸（polyP）和腺苷二磷酸（ADP）可以催化合成ATP[9]。底物polyP 因为价格低廉，性质稳定，在ATP 依赖的反应中得到了广泛应用[10-11]。

本文利用PPK 和GshF 纯酶建立级联反应，利用polyP 代替GSH 合成反应中需要添加的ATP，酶法合成了GSH；同时对酶的表达条件、系统反应条件包括底物浓度、温度和酶比例等优化后，达到了酶法高效生产GSH 的目的。

1 材料和方法

1.1 菌株与试剂

来源于菌株Thermosynechococcus elongates 的PPK和Streptococcus sanguinis 的GshF 的重组质粒均由本实验室之前工作构建，并保存于大肠杆菌Rosetta2（DE3）中[12]。ADP、GSH 和polyP 购自美国Sigma-Aldrich 公司，蛋白胨和酵母粉购自英国OXOID 公司，其他试剂均购自上海麦克林生化科技有限公司。试剂纯度为分析纯或更高纯度。

1.2 蛋白表达条件优化

取含有表达质粒的菌株，按2%接种量接入3 mL含50 mg/L 卡那霉素的Luria-Bertani（LB）培养基中，在37 ℃、220 r/min 条件下培养7 h，然后转接至50 mL LB 培养基中，在37 ℃培养至OD600达到0.6～0.8 之间，加入终浓度为0.2 mmol/L 异丙基-β-d-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导，再转入不同温度（18 ℃和37 ℃）培养至OD600为3～4。取500 μL（OD600约为3）培养的菌体于12 000 r/min，4 ℃条件下离心10 min，用20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0，含250 mmol/L NaCl）洗涤1 次后，重悬于500 μL 上述缓冲液，冰水浴中超声破碎（功率200 W，工作2 s 停4 s，90 个循环）。最后将破碎细胞液于12 000 r/min、4 ℃下离心20 min，取上清和沉淀进行聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)，分析蛋白表达情况。

1.3 蛋白纯化

将最优诱导表达条件下的细胞收集破碎后，在8 000 r/min、4 ℃离心30 min，得到含有重组蛋白的上清液，利用Ni-NTA 柱对蛋白进行亲和层析纯化。用含有10～300 mmol/L 咪唑的缓冲液梯度洗脱吸附在柱上的蛋白，SDS-PAGE 检测各个梯度的蛋白洗脱纯度，收集纯度较高的蛋白洗脱液，离心浓缩后加入0.20～0.25 g/mL 的甘油置于−80 ℃保存。

1.4 GSH 合成体系的反应条件优化

利用纯酶PPK 和GshF 构建GSH 合成体系。标准体系组成（500 μL）：200 mmol/L Tris-HCl (pH 8.5)，50 mmol/L L-Glu，50 mmol/L Gly，50 mmol/L L-Cys，40 mmol/L MgCl2，1 g/L PPK，1 g/L SS（Somatostatin），2 mmol/L DTT (D, L-Dithiothreitol)，2 mmol/L ADP，20 mmol/L polyP，45 ℃反应。按不同时间间隔取样50 μL，加入三氯乙酸（终质量浓度0.1 g/mL）终止反应，离心取上清利用HPLC 测定GSH 浓度。反应条件优化如下：在反应体系中加入不同浓度比（20∶40，20∶60，30∶60，30∶45，30∶90）的polyP 与MgCl2；在反应体系中添加不同浓度（0.5～4 mmol/L）的ADP；初始pH 8.0 时，考察不同温度（30～50 ℃）对反应的影响；当氨基酸底物浓度为120 mmol/L，SS 质量浓度为1 g/L 时，考察不同PPK 质量浓度（2～4 g/L）对反应的影响。

1.5 分析方法

细胞密度采用紫外-可见分光光度计在600 nm下检测样品吸光度值。蛋白浓度利用购自北京天根生化科技有限公司的BCA 试剂盒测定。GSH 利用高效液相色谱检测：色谱柱为日本岛津公司的Wondasil C18 柱(4.6 mm × 150 mm)，流动相A 为50 mmol/L KH2PO4与10 mmol/L 1-庚烷磺酸钠混合液(磷酸调节pH 3.0)，流动相B 为纯甲醇，流动相A 和流动相B 的体积比为95∶5，柱温30 ℃，紫外检测波长210 nm，流速0.6 mL/min。

2 结果与讨论

2.1 温度对蛋白诱导表达的影响

诱导温度对蛋白表达有着重要的影响，温度过高会使蛋白翻译较快，错误折叠率加大，容易生成包涵体，导致蛋白失活。GshF 在不同温度下诱导表达的SDS-PAGE 分析如图1（a）所示，在37 ℃和18 ℃的细胞破碎上清液中都可看到GshF 的可溶表达，但在37 ℃的裂解液沉淀中可以明显观察到有部分不可溶蛋白，说明GshF 在高温诱导时会形成少量包涵体。PPK 在不同温度下的诱导如图1（b）所示，在37 ℃和18 ℃诱导时都会形成较多的沉淀，但37 ℃表达时蛋白大部分都在沉淀中，上清液中几乎观察不到可溶蛋白，而在18 ℃表达条件下的上清液中可以观察到有可溶表达。说明PPK 在低温条件下也容易产生可溶表达，因为低温表达时，蛋白翻译折叠较慢，易于可溶蛋白的生成。

图 1 诱导温度对（a）GshF 和（b）PPK 表达的影响Fig. 1 Effect of induced temperatures on the expression of(a) GshF and (b) PPK

2.2 蛋白纯化

由于表达的GshF 和PPK 都带有组氨酸标签，因此可以通过镍离子柱亲和层析纯化。将18 ℃诱导后破碎的细胞上清液过柱洗脱后，得到GshF 和PPK 的纯酶液。利用SDS-PAGE 检测，电泳条带如图2 所示。得到的蛋白条带均一，大小都在90 ku 左右，与根据氨基酸序列推算的理论值一致。

图 2 GshF 和PPK 的纯化Fig. 2 Purification of GshF and PPK

2.3 GSH 合成反应条件优化

GshF 和PPK 合成GSH 的原理如图3 所示，GshF可以利用L-Glu，L-Cys 和Gly 合成GshF，这是一个耗能反应，需要ATP 参与供能。传统的酶法催化需要直接加入ATP，极大地增加了生产成本，不利于大规模的生产。polyP 作为能量供体，可以由PPK 催化断裂磷酸酐键，降解的磷酸基团结合ADP 生成ATP。当引入PPK 催化的反应时，在体系中初始加入一定量的polyP 和少量的ADP，即可达到代替GSH 合成反应中需要添加的ATP 的目的，让ATP 和ADP 在体系中循环再生、高效合成GSH。

图 3 GshF 和PPK 偶联合成GSHFig. 3 GSH synthesis by coupling GshF and PPK

2.3.1 PolyP 和MgCl2的浓度比例的优化 PolyP 作为能量供体，在体系内不断地被消耗，因此polyP 的供给会直接影响到ATP 的生成量，从而影响GSH 的合成效率。但是高浓度的polyP 会和MgCl2发生螯合反应，从而导致polyP 的损失，同时GshF 和PPK为MgCl2依赖的酶，Mg2+浓度的降低也会影响GshF和PPK 的活性，因此合适比例的polyP 和MgCl2对反应效率有着重要影响。如图4 所示，当polyP浓度为20 mmol/L，MgCl2浓度分别为40 mmol/L 和60 mmol/L 时，60 mmol/L 的MgCl2对体系产生了抑制作用。当polyP 浓度提高到30 mmol/L，MgCl2浓度分别为45、60 和90 mmol/L 时，MgCl2浓度越高，GSH 生产效率也越低。可以看出，当polyP 浓度一定时，MgCl2浓度越高，对反应的抑制效果越明显。实验中也发现，高浓度的polyP 和MgCl2会形成白色沉淀。这些结果说明，过高的MgCl2浓度会引起MgCl2与polyP 的螯合反应，降低GSH 的生产效率。当MgCl2浓度都为60 mmol/L 时，加入30 mmol/L polyP的体系生产效率比20 mmol/L polyP 的体系提高约50%，因为30 mmol/L polyP 时，增加了螯合后剩余的polyP 的有效浓度。当polyP 和MgCl2的浓度比为30 : 45 时，反应效率最高。这些结果说明了合适的polyP 和MgCl2的浓度比确实会对催化效率起重要作用。

图 4 不同polyP/MgCl2 浓度比对GSH 合成的影响Fig. 4 Effect of the concentration ratio of polyP to MgCl2 on the synthesis of GSH

2.3.2 初始ADP 浓度优化 ADP 是双酶反应体系中的关键辅因子，在两个反应之间起到桥梁作用。因此ADP 浓度可能会对反应体系的催化效率产生较大影响。ADP 也是反应底物中成本较高的底物之一，过多的ADP 会增加系统的成本，不利于GSH 反应的大规模应用。因此，ADP 的初始浓度直接关系到GSH 合成的催化效率和生产成本。对初始的ADP 浓度进行优化，不同ADP 浓度对GSH合成的影响结果如图5 所示。初始ADP 浓度从0.5 mmol/L 增加到4.0 mmol/L，GSH 的浓度逐渐下降，2.0 h 时GSH 的浓度从15.4 mmol/L 降到4.3 mmol/L，说明在此范围内，当ADP 浓度为0.5 mmol/L 时，反应的催化效率最高。底物ADP 浓度增加，GSH 生产效率反而降低，说明过高的ADP 浓度对GshF 和PPK 两酶偶联催化起到抑制作用，原因可能是ADP 和polyP 的催化通道在PPK 结构上较近，因为ADP 比长链的polyP 柔性较强，过多的ADP 会聚集在polyP 的催化通道入口，从而降低了polyP 被催化的活性[13]。

图 5 不同ADP 浓度对GSH 合成的影响Fig. 5 Effect of the concentration of ADP on the synthesis of GSH

图 6 温度对GSH 合成的影响Fig. 6 Effect of temperature on the synthesis of GSH

2.3.3 温度优化 温度对酶反应催化有着重要影响，一定范围内，温度升高可以提高酶活性，从而增加催化速率。对游离酶体系的温度进行优化，结果如图6 所示，在0.5 h 内，50 ℃温度下GSH 合成速率最快，GSH 浓度达到23 mmol/L。PPK 是来源于嗜热菌的酶，温度升高，可以加快ATP 的生成速率，从而提高GSH 的合成速率。在30 ℃条件下，GSH 的合成速率最慢。因为PPK 在低温下酶活性相对较低，同时根据本课题组研究，30 ℃时GshF 酶活也会下降[12]。在37～45 ℃范围内，GSH 的生产效率随着温度升高而升高。其中，在45 ℃条件下，2 h 反应即达到最高点，相比于其他条件，此条件下的反应速率和GSH 浓度都最高，分别达到了(19.5 ± 0.3)mmol/(L·h)和(39 ± 0.5)mmol/L，得率达到了78%，因此45 ℃为GSH 催化的最适温度。偶联体系的最适反应温度偏高，与GshF 和PPK 的催化性质一致，因为二者的催化活性都随着温度的升高而提高[12]。

2.3.4 酶比的优化 在多酶催化体系中，不同的酶比可以影响反应体系中的各个级联反应速率，从而影响总反应速率和生产效率，因此，在GSH 生产系统中，通过酶比的优化，可以平衡ATP 的生成和消耗，从而提高反应效率。在体系中考察了PPK 与GshF 质量浓度比分别为4∶1，3∶1 和2∶1 时酶比对反应的影响，为了防止底物氨基酸对反应的限制，在体系中将前体的浓度提高至120 mmol/L，如图7 所示，当PPK 质量浓度从2 g/L 增加到4 g/L 时，GSH 的催化效率也在不断增加，GSH 的浓度从 (45 ± 0.2)mmol/L 增加到(58 ± 3.3)mmol/L，反应速率从(15 ± 0.03)mmol/(L·h)增加到(19.3 ± 1.1)mmol/(L·h)。因为在双酶反应中，PPK 为ATP 合成反应，因此，增加PPK 的浓度，可以使得ATP 的再生速率增大，从而增加了总反应速率，提高GSH 浓度。这也说明体系中ATP 的再生速率对总催化速率的限制作用。随着反应进行，GSH 合成速率逐渐降低，导致半胱氨酸没有被进一步利用，可能是体系中polyP 降解和GSH 生成导致的pH 的下降，使得PPK 和GshF 酶活降低，无法高效生产GSH[12]。

图 7 PPK/GshF 酶比对GSH 合成的影响Fig. 7 Effect of ratio of PPK to GshF on the synthesis of GSH

3 结束语

本文通过构建双酶级联反应，利用GshF 偶联PPK 酶法合成GSH。对GshF 和PPK 诱导表达条件进行优化，两者均在18 ℃下可溶表达量最高。对GshF 和PPK 纯化后，建立纯酶反应系统，优化反应条件，认为polyP 与MgCl2浓度比在30∶45 下，ADP浓度为0.5 mmol/L，反应温度为45 ℃时，反应速率最快。当PPK 质量浓度为4 g/L，GshF 质量浓度为1 g/L 时，3 h 内GSH 浓度达到了(58 ± 3.3)mmol/L。Yu 等报道了利用乙酸激酶再生ATP 的系统生产GSH，3 h 时浓度达到了59 mmol/L，是目前报道的GSH 的最高浓度[14]，但此系统所用的高能磷酸化合物为乙酰磷酸，价格昂贵，且不稳定。本研究中的底物polyP 来源广泛，价格低廉，化学性质稳定，因此，建立的低成本、高效的酶法合成体系为GSH 大规模生产应用提供了参考依据。