血管紧张素转换酶2调节肺肾素血管紧张素系统减轻肢体缺血再灌注诱导的急性肺损伤

李树民徐洪杨奕李雅倩靳馥宇李田杨秀红杨方∗

(1.华北理工大学公共卫生学院,河北 唐山 063210;2.华北理工大学河北省器官纤维化重点实验室,河北 唐山 063210;3.华北理工大学基础医学院,河北省慢性疾病重点实验室,唐山市慢性病临床基础研究重点实验室,河北 唐山 063210;4.华北理工大学教务处,河北 唐山 063210)

肢体缺血再灌注(limb ischemia-reperfusion,LIR)是临床上常见的病理征象,与血栓形成,栓塞,创伤和长期使用止血带有关[1]。肢体恢复供血后,自由基产生增加,导致细胞钙超载,引发血管内皮细胞和中性粒细胞相互作用,炎症介质和细胞因子激活、释放,不仅会造成肢体缺血坏死,还会造成其他非缺血器官的损伤,严重者引起多脏器功能衰竭,甚至危及生命[2]。肺由于血液循环丰富,而且是静脉血液返回心脏后首个供血器官,最容易受到LIR影响[3],导致急性肺损伤(acute lung injury,ALI)甚至急性呼吸窘迫综合征[4]。但是,LIR引起ALI的机制尚未得到充分阐明。

最近研究证实,肺组织局部肾素-血管紧张素系统(renin angiotensin system,RAS)稳态失衡与ALI的发生发展密切相关[5-6]。RAS两条作用轴的正负调控平衡在维持正常生理功能中发挥重要作用。其中,血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme,ACE),及其效应分子血管紧张素II(angiotensin,Ang II)和血管紧张素II受体1(AT1)轴的激活是ALI发生发展的重要因素[7-9];随后发现的血管紧张素转化酶2(ACE2),将Ang II水解生成血管紧张素-(1-7)[Ang-(1-7)],Ang-(1-7)通过与G蛋白偶联受体Mas结合,发挥抗炎,抗纤维化,抗增殖和血管舒张作用[10-12]。因此,ACE2-Ang-(1-7)-Mas受体轴可能是肺损伤治疗的潜在靶标。

课题组前期研究发现,在LIR诱导的小鼠急性肺损伤模型中,小鼠肺组织ACE,Ang II/Ang-(1-7)和AT1/Mas表达增加,ACE2表达减少。给予ACE2激活剂三氮脒(diminazene aceturate,DIZE)预处理4周能够逆转这些变化,肺损伤程度减轻。此外,与野生型小鼠相比,给予ACE2过表达小鼠DIZE处理后,DIZE也可逆转急性肺损伤引起的RAS稳态失衡,而且效果更加明显[13]。这些结果提示,ACE2在急性肺损伤中发挥了重要的保护作用。然而,ACE2激活后,其作用是否通过ACE2-Ang-(1-7)-Mas受体轴发挥目前尚不清楚。因此,本研究采用ACE2转基因小鼠(过表达ACE2基因),构建LIR诱导的急性肺损伤模型,给予特异性ACE2抑制剂MLN-4760和特异性Mas受体阻断剂A779干预,探讨ACE2在急性肺损伤中发挥保护作用的机制,旨在发现治疗ALI的新靶标。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

SPF级8～12周龄ACE2转基因雄性ICR小鼠72只,体重(28±5)g,在华北理工大学实验动物中心SPF级动物房繁殖、饲养【SYXK(冀)2015-0038】。SPF级8～12周龄野生型ICR小鼠36只,体重(30±5)g,由北京维通利华公司提供【SCXK(京)2016-0001】。所有小鼠自由进食水,饲养环境温度23～25℃,湿度35%～55%,12 h光照/黑暗周期。所有实验程序均已获得华北理工大学伦理委员会批准(批准号2013-038和2017-025)。

1.1.2 主要试剂与仪器

A779(4030357:Bachem,瑞士);MLN-4760(530616;Millipore,德国);兔单克隆 ACE(EPR2757)、ACE2 [EPR4435(2)]、AT1(EPR3873)抗体(Epitomics,美国);鼠单克隆Mas抗体(sc-390453;Santa Cruz Biotechnology,美国);兔单克隆β-actin抗体(AC026;ABclonal Science Inc,美国);辣根过氧化物酶标记山羊抗兔(5220-0336)、山羊抗鼠(5220-0341)二抗(SeraCare,美国);BCA蛋白浓度检测试剂盒(PQ0012;联科生物,中国);Ang II(CSB-E04495 m)/Ang-(1-7)(CSB-E13763 m)酶联免疫吸附测定(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒(Cusabio,美国);白介素-6(interleukin-6,IL-6,RK00008)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α,RK00027)ELISA试剂盒(ABclonal Science Inc,美国);TRIzol(15596-018,Invitrogen,美国);反转录(ZR102-2)和qRT-PCR(ZF102-2)试剂盒(北京庄盟,中国);引物序列Thermo Fisher Scientific。

荧光显微镜(BX53,日本OLYMPUS);电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9140 A,上海浦东荣丰科学仪器有限公司);酶标仪(iMarkTM;Bio-rad,美国);Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System(Thermo Fisher Scientific,美国)。

1.2 方法

1.2.1 实验分组

野生型ICR小鼠随机分为2组,每组18只:(1)野生对照组(Control),(2)野生模型组(Model)。ACE2基因过表达ICR小鼠随机分为4组,每组18只:(1)ACE2对照组(ACE2+Control);(2)ACE2模型组(ACE2+Model),(3)ACE2模型+A779干预组(ACE2+Model+A779)和(4)ACE2模型+MLN-4760干预组(ACE2+Model+MLN-4760)。除2个对照组外,其余各组均制备LIR模型。药物干预组分别在模型建立前给予A779(5 mg/(kg·d),s.c.)和MLN-4760(1 mg/(kg·d),s.c.)4周预处理。对照组和模型组皮下注射等量生理盐水4周。

1.2.2 模型制备与样本处理

采用我室常规方法制备LIR模型。1%戊巴比妥钠(50 mg/kg,i.p.)麻醉小鼠,橡皮筋绑扎双侧后肢根部阻断肢体血流,诱导局部缺血2 h,然后去除橡皮筋恢复血液灌注。再灌注后4 h,取血处死小鼠。每组18只小鼠中,6只小鼠左肺用于检测肺组织的湿/干重比(Wet-to-Dry,W/D),右肺用4%多聚甲醛固定,用于组织学分析;6只小鼠的肺组织样本-80℃保存,用于检测RAS组分的表达;6只小鼠进行支气管肺泡灌洗,对灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)进行细胞计数、蛋白浓度测定和炎性因子分析。

1.2.3 肺组织脏器系数与湿/干重比值(W/D)测定

小鼠处死后,电子天平称体重(灵敏度为0.01 g);开胸分离双侧肺,滤纸轻轻吸干表面血液;分析天平(灵敏度为0.0001 g)称量两肺及左肺重量(湿重);将左肺放入真空干燥箱中(60℃)72 h后,重新称取左肺重量(干重)。肺组织脏器系数=两肺样本的湿重/体重×100%;肺组织W/D=左肺湿重/干重。

1.2.4 肺组织学分析

小鼠右肺组织在4%多聚甲醛中固定24 h,常规石蜡切片,苏木精和伊红(HE)染色,光学显微镜下观察肺组织学变化,并评估肺损伤程度。主要基于以下指标分析每个样本的病变程度:(1)肺泡壁毛细血管扩张充血;(2)肺泡出血;(3)肺泡壁炎性细胞浸润;(4)肺泡间质增厚/水肿。每个指标分为5个等级:0分(无损伤),1分(轻度损伤,损伤范围≤25%/视野),2分(中度损伤,损伤范围26%～50%/视野),3分(重度损伤,损伤范围51%～75%/视野),4分(极重度损伤,损伤范围76%～100%/视野)。对4项指标的分数求和,取随机10个视野的平均值作为最终结果[14]。

1.2.5 ELISA法检测肺组织Ang II和Ang-(1-7)浓度

适量肺组织剪碎,在磷酸盐缓冲液(PBS,1 mL/100 mg)中匀浆;匀浆液置于-20℃,经过两次冻融后,3000 r/min,4℃离心20 min,取上清。按照ELISA试剂盒使用说明操作。酶标仪检测450 nm吸光度值,绘制标准品标准曲线,计算肺组织样本Ang II和Ang-(1-7)的浓度。

1.2.6 肺泡灌洗液收集与分析

1%戊巴比妥钠麻醉小鼠,仰卧位固定,颈部正中切开皮肤,分离气管,在甲状软骨下约0.2 cm插入20 g钝针头,结扎气管和针头,1 mL预冷PBS注入肺组织,停留1 min后吸出灌洗液,反复抽吸3次留存;重复此步骤3次,混合3次灌洗液,4℃1500 r/min离心10 min,分离上清和沉淀。用血细胞计数板对沉淀中的细胞进行计数。按照试剂盒说明书,BCA法检测上清液中蛋白浓度;ELISA法检测IL-6和TNF-α的浓度。

1.2.7 肺组织总RNA提取及实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测ACE/ACE2的mRNA表达水平

适量肺组织在液氮中研磨,使用TRIzol试剂提取肺组织总 RNA,NANO Drop 2000C Spectrophotometer测定RNA浓度和纯度。以2μg RNA为模板,按照逆转录酶试剂盒说明操作合成cDNA。以cDNA为模板,进行qRT-PCR扩增;根据相应样本中β-肌动蛋白(β-actin)的Ct值,用2-△△Ct表示样本结果。引物序列:ACE sense,5′-CAGTGTCTACCCCCAAGCAT-3′,ACE antisense,5′-CTTCCATCAAAGACCCTCCA-3′[14];ACE2 sense,5′-CCTTCTCAGCCTTGTTGCTGTTAC-3′,ACE2 antisense,5′-TGCCCAGAGCCTAGAGTTGTAGTC-3′[15]; β-actin sense,5′-GTCGTACCACAGGCATTGTGATGG-3′;and β-actin antisense,5′-GCAATGCCTGGGTACATGGTGG-3′[14]。反应条件为:94℃2 min,随后94℃15 s,60℃30 s,共40个循环。

1.2.8 Western Blot检测肺组织ACE/ACE2与AT1/Mas受体蛋白表达

称取肺组织,加入含有1%蛋白酶抑制剂的冷RIPA裂解液(1 mL/100 mg),冰上超声匀浆,裂解物12 000 r/min,4℃离心20 min,取上清。BCA法检测蛋白浓度。用RIPA裂解液调整样本蛋白浓度至5μg/μL,按照1∶4比例与5×上样缓冲液混匀,100℃加热10 min。30μg蛋白用于10%SDS-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳;90 V恒压转膜(PVDF膜);5%脱脂奶粉封闭1 h,孵育ACE(1∶1000稀释)、ACE2(1∶1000稀释)、AT1(1∶1000稀释)和Mas(1∶300稀释)一抗4℃过夜;次日HRP标记二抗37℃孵育1 h;ECL显影;Image J分析结果。

1.3 统计学分析

计量资料以平均值±标准差(±s)表示,使用SPSS 17.0统计软件对数据进行统计分析。多组间均数比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),进一步两两比较采用Least Significant Difference(LSD)检验。P<0.05表示差异具有显著性。

2 结果

2.1 过表达ACE2基因减轻小鼠肺组织学变化

肉眼观,野生对照(Control)和ACE2对照组(ACE2+Control)小鼠肺组织颜色粉红有弹性;经过肢体缺血再灌注处理的小鼠肺体积增大,呈暗红色,尤以野生模型组(Model)最为明显。光镜下HE染色结果显示(图1A),野生和ACE2对照组小鼠,肺组织结构清晰,肺泡壁薄,无明显充血及炎细胞浸润。野生模型组小鼠肺泡壁毛细血管扩张充血,偶可见出血,肺泡腔内及肺泡壁大量炎性细胞浸润,肺泡间质增厚、水肿。ACE2模型组(ACE2+Model)小鼠肺组织病理学变化较轻。然而,给予A779(ACE2+Model+A779)和MLN-4760(ACE2+Model+MLN-4760)干预后再进行LIR处理,加剧了LIR对ACE2小鼠肺组织的损伤程度。进一步进行肺损伤评分,如图1B显示,野生对照和ACE2对照组肺损伤评分无显著差异。与野生对照组相比,野生模型组肺损伤评分明显升高(P<0.01);ACE2模型组较野生模型组评分显著减低(P<0.01),而A779和MLN-4760处理后ACE2模型组肺损伤评分增加(P<0.01)。

2.2 过表达ACE2基因降低小鼠肺泡毛细血管通透性

如图2所示,与野生对照组相比,野生模型组小鼠肺组织脏器系数(图2A)、W/D比值(图2B),肺泡灌洗液中细胞计数(图2C)和蛋白浓度(图2D)明显升高(P<0.01);与ACE2对照组相比,ACE2模型组各项指标仅轻度升高(P<0.05),且较野生模型组显著降低(P<0.01,P<0.05);给予MLN-4760和A779干预后,各指标又较ACE2模型组明显升高(P<0.05,P<0.01)。

2.3 过表达ACE2基因降低小鼠BALF炎性细胞因子表达

如图3所示,与野生对照组相比,野生模型组小鼠肺泡灌洗液中IL-6(图3A)和TNF-α(图3B)表达明显升高(P<0.01);与ACE2对照组相比,ACE2模型组肺泡灌洗液中两炎性因子浓度仅轻微升高(IL-6,P>0.05;TNF-α,P<0.05),且较野生模型组显著降低(P<0.01);A779和MLN-4760干预,取消了过表达ACE2的作用,IL-6和TNF-α表达较ACE2模型组升高(P<0.05)。

图1 过表达ACE2基因减轻小鼠肺组织学变化(±s,n=6)Note.A,Pathological changes in the lungs of ACE2 transgenic mice subjected to limb ischemia-reperfusion.HE staining,magnification of×40 and×200.B,Lung injury score:semi-quantitative pathological analysis based on HE staining.∗P<0.05,∗∗P<0.01.Figure 1 Overexpression of ACE2 attenuates lung injury in mice(±s,n=6)

图2 过表达ACE2基因减轻小鼠肺泡毛细血管通透性(±s,n=6)Note.∗P<0.05,∗∗P<0.01.(The same in the following figures)Figure 2 Overexpression of ACE2 reduces the permeability of alveolar capillaries in mice(±s,n=6)

图3 过表达ACE2基因降低小鼠肺泡灌洗液中IL-6和TNF-α表达(±s,n=6)Figure 3 Overexpression of ACE2 reduces the expression of IL-6 and TNF-αin the BALF in mice(±s,n=6)

2.4 过表达ACE2基因调节小鼠肺组织RAS表达

与野生对照组相比,野生型ICR小鼠LIR处理后,肺组织ACE2 mRNA(图4A)和蛋白(图5B)表达水平降低(P<0.01,P<0.05),ACE mRNA(图4B)和蛋白(图5C)表达水平升高(P<0.01)。ACE2对照组小鼠,肺组织ACE2 mRNA和蛋白水平较野生对照组明显升高,经过LIR处理后,ACE2(mRNA/蛋白)水平降低(P<0.05,P<0.01),ACE(mRNA,P<0.01/蛋白,P>0.05)水平升高。进一步与野生模型组比较,二者变化较野生模型组明显减轻(P<0.01,P<0.05)。A779和MLN-4760干预加剧了ACE2模型组的变化(P<0.01,P<0.05)。

结果提示,肢体缺血再灌注后,小鼠肺组织AT1(图5D)和Mas(图5E)蛋白表达同样发生了变化。野生模型组和ACE2模型组AT1和Mas受体的蛋白表达均较相应对照组增加(P<0.01,P<0.05);但ACE2模型组较野生模型组AT1水平更低(P<0.05),Mas水平更高(P<0.01)。应用A779和MLN-4760使ACE2模型组小鼠肺组织Mas水平降低(P<0.01),AT1进一步升高(P<0.01,P<0.05)。如图5F所示,ACE2模型组AT1与Mas的比值低于野生模型组(P<0.05),药物干预后比值升高(P<0.01)。且与ACE2对照组相比,AT1与Mas蛋白的比值在ACE2模型组略有降低(P>0.05)。

检测肺组织ACE和ACE2的效应分子Ang II和Ang-(1-7)的表达,发现这两个效应分子的变化与ACE和ACE2的变化不一致。野生模型组和ACE2模型组Ang II(图6A)和Ang-(1-7)(图6B)的浓度均较相应对照组增加;但ACE2模型组较野生模型组AngII水平更低(P<0.05),Ang-(1-7)水平更高(P<0.01)。应用A779和MLN-4760使ACE2模型组小鼠肺组织Ang-(1-7)水平降低(P<0.05,P<0.01),Ang II进一步升高(P<0.05)。进一步比较Ang II与Ang-(1-7)的比值发现,ACE2模型组和药物干预组的变化与相应各组ACE蛋白水平的变化类似(图6C)。

图4 过表达ACE2基因调节小鼠肺组织ACE2和ACE mRNA表达(±s,n=6)Figure 4 Overexpression of ACE2 regulates lung mRNA levels of ACE2 and ACE in mice(±s,n=6)

图5 过表达ACE2基因调节小鼠肺组织ACE2、ACE、AT1和Mas受体蛋白表达(±s,n=6)Figure 5 Overexpression of ACE2 regulates the protein expression of ACE2,ACE,AT1,and Mas in the lungs of mice(±s,n=6)

图6 过表达ACE2基因调节小鼠肺组织Ang II和Ang-(1-7)表达(±s,n=6)Figure 6 Overexpression of ACE2 regulates lung Ang II and Ang-(1-7)in mice(±s,n=6)

3 讨论

肾素-血管紧张素系统(RAS)是人和动物体内重要的体液调节系统,以循环和局部两种形式,在调节血压、水和电解质平衡以及器官功能中发挥重要作用。近年来研究表明,肺组织局部RAS参与了急性肺损伤的发生与发展[7-9]。

研究结果表明,野生型和过表达ACE2基因小鼠在肢体缺血再灌注处理后均出现了典型的肺损伤的组织学表现,肺组织脏器系数、湿/干重比值、BALF蛋白浓度和细胞计数明显升高,同时肺组织ACE、Ang II和AT1受体表达升高。这些结果提示ACE-Ang II-AT1轴的激活可能参与了LIR后小鼠急性肺损伤的病理过程。已有研究表明,ALI的早期主要表现为血管内皮细胞损伤,而Ang II是重要的血管损伤因子,Ang II的过度表达可通过AT1受体引起内皮细胞肿胀和变性[14]。Ang II还可显著诱导肺上皮细胞凋亡,导致上皮屏障功能受损和通透性增加[16]。此外,增高的Ang II抑制肺泡上皮的钠离子通道,诱导肺组织水通道蛋白1和水通道蛋白5的异常表达[17-18],引起肺泡壁通透性增加,液体清除率降低,导致肺水肿和渗出液中蛋白质含量增加[7,17]。Ang II还刺激多种炎症反应,激活炎症因子,导致炎症损伤。其中,IL-6和TNF-α已被动物实验和临床研究证实参与了急性肺损伤的发生与发展[19-20]。有学者认为,早期检测外周血IL-6和TNF-α水平可以预测急性胰腺炎引发的急性肺损伤的发生,并对评估急性肺损伤的严重程度和预后具有重要价值[21]。本研究结果也提示,在两个基因型的模型组小鼠中,肺泡灌洗液IL-6和TNF-α浓度升高,尤以野生模型组升高更为明显。

近年来,随着ACE2的发现,ACE2-Ang-(1-7)-Mas轴在呼吸系统疾病中的作用越来越受到重视。研究表明,ACE2在肺泡上皮和肺血管内皮细胞均有表达[22-23]。ACE2能够抑制炎症损伤,从而保护肺组织免受损伤的影响[10,24-27];敲除小鼠ACE2基因会导致ACE/ACE2与Ang II/Ang-(1-7)稳态失衡,加重肺部损伤[14],给予合成ACE2会显著减轻肺组织病理变化[28]。我们的前期研究也发现,无论是外源性激活(DIZE干预)还是内源性高表达ACE2基因,均能减轻LIR诱导的小鼠急性肺损伤[13];而且,DIZE的作用可被特异性酶抑制剂MLN-4760和Mas受体阻断剂A779所取消(文献尚未发表)。在本研究中,LIR引起两种基因型小鼠肺组织ACE、Ang II、AT1表达增加,ACE2表达减少,但与野生模型组相比,过表达ACE2基因显著降低了模型组肺组织中ACE-AngII-AT1轴组分的变化幅度。此外,过表达ACE2基因,还减轻了肺组织的病变程度,降低了肺泡毛细血管通透性,降低了肺泡灌洗液中IL-6和TNF-α的表达。然而,ACE2的这些有益作用被MLN-4760和A779所消除。因此,可以推断ACE2可能通过ACE2-Ang-(1-7)-Mas轴调控RAS,进而发挥对小鼠急性肺损伤的保护作用。

研究中我们还发现,野生型和ACE2基因过表达小鼠LIR后,肺组织Ang-(1-7)和Mas受体的表达均增加,这与ACE2的结果变化不一致。这种不一致可以通过以下几种原因解释:(1)Ang-(1-7)除通过ACE2水解Ang II产生外,还可以通过其他代谢途径生成,比如它可以通过中性内肽酶(NEP)/脯氨酰内肽酶(PEP)的催化作用从Ang I产生,或者通过ACE/NEP从Ang-(1-9)中分离出来[29]。(2)在过表达ACE2基因小鼠中,肺组织ACE2 mRNA和蛋白表达水平高于野生型小鼠[13-14],而LIR小鼠肺组织的Ang II水平也较高,因而为升高的ACE2提供了更多的底物,产生更多的Ang-(1-7)。(3)Ang-(1-7)升高会激活Mas受体并增加受体的表达[30],二者结合发挥对ALI的保护作用。尽管Ang-(1-7)和Mas受体的表达增加,但从模型组Ang II与Ang-(1-7)的比值,以及AT1/Mas的比值上看,两个模型组Ang II/Ang-(1-7)的比值,以及野生模型组AT1/Mas的比值仍高于对照组,因此,LIR小鼠肺组织Ang-(1-7)的水平不足以完全对抗Ang II的致损伤作用,最终导致肺损伤。但与野生型小鼠相比,ACE2过表达小鼠肺组织ACE2和Ang-(1-7)水平较高,能够更好的拮抗ACE-Ang IIAT1轴的作用,肺部损伤程度较轻。ACE2过表达模型组中ACE蛋白表达水平无明显变化也证实了这一点。此外,有文献报道,脂多糖诱导的肺损伤的恢复时间为Ang-(1-7)干预后3 d,3 d后较高水平的Ang-(1-7)可能与Mas受体结合发挥保护作用[31]。而本研究观察的是缺血再灌注后4 h肺组织RAS的变化,与文献报道时间相比,还处于早期阶段,Ang-(1-7)的保护作用还不能有效发挥。

总之,肺组织RAS稳态失衡在急性肺损伤的发生发展中发挥重要作用。本研究证实了ACE2可通过激活ACE2-Ang-(1-7)-Mas受体轴,改善RAS稳态失衡,进而减轻肢体缺血再灌注引发的急性肺损伤。因此,靶定ACE2对RAS稳态的调节,可以作为治疗急性肺损伤的有效策略。