甘草附子汤对小鼠疼痛模型及寒湿证疼痛模型止痛作用比较研究

靳 荃，青千裕，郜宪明，赵子苇，赵 乐，李艳彦，王永辉，孙力威

（1.山西中医药大学，山西晋中030619； 2.香港浸会大学中医药学院，香港999077）

甘草附子汤出自《伤寒杂病论》117条，“风湿相搏，骨节疼烦，掣痛不得屈伸，近之则痛剧，汗出短气，小便不利，恶风不欲去衣，或身微肿者，甘草附子汤主之”。该方由炙甘草、炮附子、白术、桂枝四味药组方而成，具有祛风除湿、温经散寒、温阳补中的功效。小鼠热板法与小鼠扭体法是经典的药理学疼痛模型，可从不同角度证明药物的止痛作用。关于中药及药物有效成分止痛实验的文献报道较多［1-2］，但极少有文献报道方剂对中医病证结合模型止痛实验方面的研究［3］。本研究拟通过研究甘草附子汤对小鼠经典疼痛模型与寒湿证疼痛模型的止痛作用，探究方剂与中医证候模型之间的相关性。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 药品与动物 塞来昔布（辉瑞制药有限公司，J20140072）；醋酸溶液（国药集团化学试剂公司，20150607）。SPF 级 CD-1（ICR）小鼠 140只，雌性，6～8 周龄，体质量（28±5）g，SCXK（京）2016-0006，北京维通利华实验动物中心提供。温度（19±2）℃，湿度40%～60%，饲养于山西中医药大学实验中心，适应性喂养1周，期间充足摄食、摄水。

1.1.2 实验仪器 DHP-9082B型恒温箱（上海一恒公司），RB-200智能热板仪（成都泰盟科技有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 热板实验

1.2.1.1 中药复方制备 甘草附子汤组成按《金匮要略》原方剂量换算（1两=3 g），煎煮2次，合并滤液，并浓缩至含生药剂量5 g/kg，冰箱保存备用。

1.2.1.2 热板实验前小鼠筛选 雌性小鼠80只，放入温度已控制好的热板仪上（55±0.5）℃，立即开始计时，并盖上有机玻璃罩避免小鼠跃出，仔细观察，待小鼠舔后足时马上停止计时。开始舔脚时间在10～30 s之间为正常痛阈值，其他时间段均剔除，小鼠有跳跃的情况也剔除。筛选痛阈值合格的小鼠60只，间隔5 min后，再次测定痛阈值，以2次平均值作为小鼠给药前的正常痛阈值。

1.2.1.3 分组与给药 将符合条件的小鼠60只，采用随机数字表法分为6组，对照组、甘草附子汤组、塞来昔布组、寒湿证模型组、寒湿证甘草附子汤组、寒湿证塞来昔布组，每组10只。小鼠寒湿证模型的建立：除对照组、甘草附子汤组、塞来昔布组外，其余各组小鼠每日上午9点开始于水温（14.0±0.5）℃水中游泳至力竭下沉时捞出，下午2点将小鼠置于人工气候箱［温度：（4±0.5）℃，湿度：90%～95%）］中 4 h［4-5］，连续刺激 15 d。除对照组及寒湿证模型组灌胃生理盐水外，其余组灌胃相应药物：甘草附子汤剂量为10.92 g/kg，塞来昔布胶囊以蒸馏水溶解，浓度为30.04 mg/kg，灌胃容积为0.15 mL/10 g，每天1次，连续15 d。

1.2.1.4 观察指标 灌胃结束后，在安静的环境中，分别测定各组小鼠灌胃后45 min、90 min、135 min、180 min时小鼠的痛阈值。将各组小鼠放入温度已控制好的热板上（55±0.5）℃，立即开始计时，并盖上有机玻璃罩避免小鼠跃出，仔细观察，记录各组小鼠开始舔脚时间，待小鼠舔后足时马上停止计时。若小鼠放入热板仪中60 s仍无反应，痛阈值按60 s计。

1.2.2 扭体实验

1.2.2.1 分组与给药 方法同1.2.1.1。小鼠寒湿证模型的建立同1.2.1.3。

1.2.2.2 观察指标 各组小鼠末次灌胃30 min后，腹腔注射0.6%冰乙酸（0.1 mL/10 g），立即将小鼠单只放入笼内，观察15 min内小鼠出现扭体反应的潜伏期（注射冰乙酸后至第一次扭体反应出现的时间）和扭体次数。

1.3 统计学方法

所有数据采用SPSS 20.0统计软件进行处理，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，统计分析采用重复测量方差分析法，多组间比较采用完全随机设计方差分析法（ANOVA），以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠一般情况

对照组小鼠口唇红润，毛发光泽，对外界刺激反应灵敏，体重逐渐增高。寒湿证小鼠造模期间，逐渐出现大便变稀，体重升高变慢，毛发颜色变暗。造模15 d后小鼠毛发不泽，甚至稀疏粗糙，小鼠状态萎靡，嗜睡，对外界刺激反应较慢，饮食减少，体重增加较慢，足趾及尾巴颜色变浅甚至出现瘀斑，大便稀。给药后寒湿证塞来昔布组小鼠毛色逐渐恢复光泽，足趾颜色浅灰，瘀斑减轻，仍大便偏稀，皮肤青灰。给药后寒湿证甘草附子汤组毛发开始有光泽，足趾颜色恢复正常，在笼内活动增多，饮食量变大，大便在给药后第5天即由稀溏变为正常。

2.2 热板实验

2.2.1 甘草附子汤对小鼠疼痛出现时间的影响 与对照组比较，在给药后90 min塞来昔布组舔脚时间延长（P＜0.05）；与寒湿证模型组比较，在给药后135 min寒湿证甘草附子汤组舔脚时间变长（P＜0.01）。与甘草附子汤组比较，在给药后180 min，寒湿证甘草附子汤组、寒湿证塞来昔布组舔脚时间变长（P＜0.05）。结果见表 1。

2.2.2 尾巴情况 造模第7天，寒湿证模型组及寒湿证塞来昔布组、寒湿证甘草附子汤组小鼠尾巴皮肤均变暗，颜色发青。造模第15天，以上各组小鼠尾尖颜色变青，甚至出现尾尖坏死情况。给药后寒湿证塞来昔布组小鼠尾巴颜色未恢复正常。寒湿证甘草附子汤组小鼠给药10 d后尾巴颜色即恢复正常。

2.2.3 关节、皮肤变化 造模第7天，寒湿证模型组及寒湿证塞来昔布组、寒湿证甘草附子汤组部分小鼠出现足背颜色变深，有水肿出现；造模第15天，更多小鼠出现足背水肿情况，甚至部分小鼠出现趾端坏死情况。给药15 d后，寒湿证塞来昔布组小鼠足背水肿程度变轻，颜色稍显青黑；寒湿证甘草附子汤组足背水肿消失，颜色恢复红润。

2.2.4 大便情况 对照组小鼠粪便呈颗粒状，中等硬度。在造模第5天，寒湿证模型组、寒湿证塞来昔布组和寒湿证甘草附子汤组部分小鼠出现粪便不成形或稀溏；给药15 d后，寒湿证甘草附子汤组大便逐渐变硬，寒湿证塞来昔布组小鼠大便普遍偏稀，仅有少部分大便成形。

表1 甘草附子汤对小鼠疼痛出现时间的影响 （s，±s）

表1 甘草附子汤对小鼠疼痛出现时间的影响 （s，±s）

注：与对照组比较，1）P＜0.01；与寒湿证模型组比较，2）P＜0.05；与甘草附子汤组比较，3）P＜0.05

组别 n对照组 10甘草附子汤组 10塞来昔布组 10寒湿证模型组 10寒湿证甘草附子汤组 10寒湿证塞来昔布组 10开始舔脚时间给药后45 min 给药后90 min 给药后135 min 给药后180 min 12.12±3.24 13.29±4.72 12.63±3.49 17.88±5.68 13.49±5.08 16.07±7.55 18.80±7.43 14.57±4.26 15.14±3.95 18.75±2.991） 19.70±4.54 23.28±7.76 12.19±3.53 14.93±4.08 15.57±3.53 17.08±5.21 14.81±3.60 16.73±2.56 22.52±8.482） 21.93±3.743）14.14±8.24 15.07±5.61 18.20±6.68 22.21±5.533）

2.3 甘草附子汤对寒湿证疼痛模型小鼠扭体实验的影响

与对照组比较，塞来昔布组扭体次数减少（P＜0.05），扭体潜伏期时间延长（P＜0.01）；与寒湿证模型组比较，寒湿证塞来昔布组小鼠扭体次数减少、潜伏时间延长（P＜0.05），寒湿证甘草附子汤组扭体次数减少（P＜0.01）。与甘草附子汤组比较，寒湿证甘草附子汤组扭体次数减少、潜伏时间延长（P＜0.05）。结果见表 2。

表2 甘草附子汤对寒湿证疼痛模型小鼠扭体实验的影响 （±s）

表2 甘草附子汤对寒湿证疼痛模型小鼠扭体实验的影响 （±s）

注：与对照组比较，1）P＜0.05，2）P＜0.01；与寒湿证模型组比较，3）P＜0.05；与甘草附子汤组比较，4）P＜0.05

组别 n对照组 10甘草附子汤 10塞来昔布组 10寒湿证模型组 10寒湿证甘草附子汤组 10寒湿证塞来昔布组 10扭体次数（次） 潜伏时间（s）37.20±3.97 14.34±1.22 32.70±6.54 14.02±2.07 29.70±7.661） 15.22±1.142）36.70 ±6.06 14.18±0.97 28.50 ±4.654） 16.20±1.624）32.10 ±4.253） 15.39±0.703）

3 讨论

实验结果显示，与寒湿证模型组比较，寒湿证甘草附子汤组扭体次数减少（P＜0.01），且在给药后 135 min舔脚时间变长（P＜0.01）；与甘草附子汤组比较，寒湿证甘草附子汤组扭体次数减少、潜伏时间延长（P＜0.05），且在给药后 180 min舔脚时间变长（P＜0.05）。由此可以得出，甘草附子汤对寒湿证疼痛模型的止痛作用更加显著。

甘草附子汤由炙甘草、炮附子、白术、桂枝四味药组成。方中炙甘草味甘性温，既可补中益气，又可缓急止痛；附子味辛甘性大热，可温阳散寒定痛；白术味甘性温，益气健脾，性燥又可祛除湿邪；桂枝味辛甘性温，有祛风散寒、温通经络之功。诸药相伍，寒邪得散，湿滞得除，经络得通，疼痛可止。故本方对寒湿证疼痛有良好的治疗作用。现代实验研究表明，甘草对拘急疼痛小鼠有抑制作用［6］；不同方法炮制的附子对热板法及扭体法小鼠均具有一定镇痛作用［7］；甘草附子汤中黑顺片配伍甘草能够抑制炎性细胞的分泌，有一定的镇痛作用［5］；白术具有一定的镇咳、祛痰及镇痛作用［8］；桂枝对小鼠扭体反应具有一定的抑制作用［9］。甘草附子汤中的四味药，均有止痛作用，对于热板实验和扭体实验所引起的疼痛都有不同程度的抑制作用。甘草附子汤的主要药理成分为乌头碱、甘草苷、甘草异素等，甘草苷可降低乌头碱的毒性，加强乌头碱的止痛作用；甘草异素可缓解平滑肌痉挛［10］。白术、甘草和桂枝与附子同煮，可促进附子中的生物碱溶出［11］。可见甘草附子汤主要由乌头碱和甘草异素发挥作用，达到止痛的作用。临床研究表明，甘草附子汤能够迅速改善寒湿痹阻型急性痛风性关节炎症状，可有效降低C反应蛋白水平，具有良好的镇痛作用［13］。

小鼠热板法是由于温度刺激小鼠足爪引起小鼠疼痛中枢兴奋产生痛觉，小鼠通过舔脚以减轻疼痛。经过寒湿环境的持续刺激，寒湿证模型小鼠在造模成功后，寒湿之气凝结体内，对热的刺激更加耐受，尤其是在给药90 min之后，寒湿证模型各组舔脚时间均变长。甘草附子汤有温阳散寒之功，且甘草附子汤药物都有一定的止痛作用，故寒湿证小鼠灌胃甘草附子汤后止痛作用更为明显。小鼠扭体法是由于小鼠腹腔注射冰醋酸刺激腹腔内组织引发腹腔炎症反应，与外周神经相关，小鼠腹腔内组织受刺激后自发通过扭动身体以减轻疼痛刺激。甘草附子汤作用于寒湿证模型疼痛小鼠在散寒祛湿的同时又通络止痛，可减轻小鼠腹腔内刺激而减轻疼痛。

中医学认为疾病的发生是由于人体气血阴阳失衡，从而表现出一类症状，这一类症状可以归纳为一个或多个证候，选择与证候相应的方剂或药物治疗疾病，就是“方证相应”［13-14］。张仲景在《伤寒论》中言“观其脉症，知犯何逆，随证治之”，就是要把握疾病之后隐藏的证候。方剂发挥治疗作用与中医证候之间密切相关，甘草附子汤有散寒除湿止痛之功，用于寒湿证疼痛有更好的治疗作用，此研究为方证相关理论提供了实验依据。