桂枝茯苓丸对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠的防治作用及机制研究

郭文娟 ，王 青 ，刘建春 ，姜维佳 ，何奕佳 ，肖保国 ，马存根 ，2

（1.山西中医药大学“2011”协同创新中心/神经生物学研究中心，山西晋中030619；2.大同大学脑科学研究所，山西大同037009； 3.复旦大学华山医院神经病学研究所，上海200025）

多发性硬化（multiple sclerosis，MS）是以中枢神经系统（central nervous system，CNS）白质炎性脱髓鞘病变为特点的自身免疫性疾病，呈慢性病程，倾向于青壮年罹患。实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmuneencephalomy elitis，EAE）与MS在临床、病理、免疫等方面具有许多相似的特征，被认为是研究MS的经典动物模型。迄今为止MS尚无有效的治疗手段，长期激素、免疫抑制剂等治疗虽能改善部分患者症状，但不良反应较大［1］。

中医学通过对MS的探索研究认为，本虚标实是其基本特征，血瘀证为MS辨证论治中的常见证型，活血能明显改善临床症状［2］。桂枝茯苓丸出自《金匮要略》，方中桂枝、茯苓、丹皮、芍药、桃仁各等分，全方燮理阴阳、调和肝脾肾、活血化瘀、温通经脉、和营止痛，与MS本虚标实、血瘀之病机切合，临床上桂枝茯苓丸用于瘀阻脉络的神经系统疾病疗效显著［3-4］。

近年现代药理实验研究发现：桂枝茯苓丸在临床应用中具有增强免疫、抗炎、调节激素水平、降低血黏稠度、抗组织增生、神经保护及改善肾功能等作用［5］。复方桂枝茯苓丸能降低脑缺血再灌注大鼠血清中促炎性细胞因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、内皮素（ET）的含量［6］。赤芍的主要成分为芍药苷（paeoniflorin，PF），PF通过抗氧化和神经保护作用能使EAE小鼠脊髓内神经炎性反应缓解［7］。本研究用桂枝茯苓丸干预EAE小鼠，初探其防治作用及部分可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 健康清洁级雌性8～10周龄C57BL/6小鼠24只，体质量约18～20 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：SCXK（京）2016-0011。实验前小鼠在无病原菌动物房（25℃左右）饲养，期间自由喂食饮水1周。

1.1.2 药物 桂枝茯苓丸（GZFLW）：山西天生制药有限责任公司，6 g/丸，批号：116002。桂枝茯苓丸药物制备：将药物研磨加入开水搅拌。桂枝茯苓丸高剂量组（GZFLWL）8 g/kg灌胃（按临床剂量40倍计算，相当于临床等效量的4倍），每日2次，0.5 mL/次；中剂量组（GZFLWM）4 g/kg灌胃（按临床剂量20倍计算，相当于临床等效量的2倍），每日 1 次，0.5 mL/次；低剂量组（GZFLWL），2 g/kg（按临床剂量10倍计算，相当于临床等效量）灌胃，每日 1 次，0.25 mL/次。

1.1.3 试剂与仪器 髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35～55多肽（myelin oligodendrocyte glycoprotein 33～55 peptide，MOG35～55）：上海强耀生物科技有限公司，5.0 mg/支，纯度 98.39%，批号 9001；结核分枝杆菌：美国DIFCO公司，100 mg/支，批号231141；完全弗氏佐剂（Complete Freund′s Adjuvant）：美国Sigma公司，10 mL/支，批号 60103；ELISA试剂盒［白介素-6（IL-6），批号 100405；TNF-α，批号102007）］：美国PEPROTECH公司；酶联免疫检测仪（SYNERGY/H 1）：美国伯腾仪器有限公司。二氧化碳培养箱：美国Thermo公司；电子秤：北京塞多利斯科学仪器厂；Millipore纯水机：美国Millipore公司；台式离心机：上海沪上仪器，DL-L8M；低温台式离心机（3～18 K）：美国 SIGMA 公司；移液枪：美国Thermo Fisher公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组 雌性C57BL/6小鼠实验前在无特殊病原菌实验室自由饮食喂养1周后，按体质量随机分为桂枝茯苓丸高、中、低剂量组及EAE模型组（EAE），每组8只。

1.2.2 EAE模型制备及给药 MOG35-55抗原乳剂的配制和注射均严格按照文献［8］的方法进行。称取5 mg MOG35-55溶解于1 mL 0.9%氯化钠溶液中，6 mg TB溶于1 mL CFA；然后将两种溶液充分混合，制成油包水样抗原乳剂。在小鼠脊柱腰骶膨大处背侧中线两侧分4点皮下注射抗原乳剂0.1 mL，在免疫当日和免疫48 h后每只小鼠腹腔注射百日咳毒素（PTX）300 ng/次以增强免疫反应。小鼠出现尾部肌张力下降症状为EAE发病起始，即模型制备成功［9］。

桂枝茯苓丸干预组于免疫后第3天，给予高、中、低剂量灌胃持续至免疫后第28天。EAE模型组以0.5 mL/只生理盐水灌胃。

1.3 检测指标与方法

1.3.1 神经功能评分 采用国际通用的5分制评分标准进行临床评分。症状介于两标准之间者以±0.5 分计［10］。

表1 临床评分标准

1.3.2 一般指标 自免疫当日开始隔日测量实验动物体重。

1.3.3 炎性因子检测 免疫后第28天，腹腔注射10%水合氯醛麻醉小鼠（0.2 mL/只）后用灭菌手术器械取脾，放入高糖无菌培养液中制备单个核细胞悬液。细胞计数后取部分细胞培养（37℃，5%CO2）48 h后取上清液，ELISA法检测脾细胞上清液炎性因子IL-6、TNF-α含量。

1.3.4 病理组织 4%多聚甲醛灌流进行体内组织固定，然后分离脊髓，OCT包埋剂包埋，于液氮中冷冻，做厚度为10 μm的冰冻切片，进行脊髓髓鞘染色和HE染色。

1.4 统计学方法

采用GraphPad Prism 5软件进行统计分析，计量数据以均数±标准差（±s）表示，临床症状评分组间比较采用秩和检验，其余组间比较采用单因素方差分析，率的比较采用卡方检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对EAE神经功能评分的影响

EAE模型组小鼠于免疫后第12天开始起病，免疫后第22天左右达到高峰。实验数据表明，与模型组比较，桂枝茯苓丸高、中、低剂量组均可减轻EAE临床症状，降低神经功能评分（P＜0.01），以中剂量组效果最优。故后续实验以中剂量为最终给药剂量，后续实验称为桂枝茯苓丸组。结果见图1。

图1 对EAE神经功能评分的影响

2.2 对EAE小鼠体质量的影响

从免疫开始到免疫后第10天左右，EAE模型组小鼠与桂枝茯苓丸组小鼠体质量差异不明显（P＞0.05），第10～26天两组小鼠体质量差异变大，EAE模型组临床症状加重，体质量明显降低，而桂枝茯苓丸组小鼠体质量减轻不明显，其差异具有统计学意义（P＜0.01）。结果见图2。

图2 对EAE小鼠体质量的影响

2.3 对EAE小鼠脊髓炎性细胞浸润和髓鞘脱失的影响

HE染色10倍镜下显示，临床症状较重的EAE模型组小鼠脊髓有大量炎性细胞浸润，桂枝茯苓丸组可有效抑制EAE小鼠脊髓炎性细胞浸润（P＜0.01）。髓鞘染色积分光密度IOD显示，EAE模型组小鼠脊髓有明显的片状脱髓鞘区（图中蓝颜色部分为白质，是髓鞘脱失的病理部位，蓝颜色中白色部分即为脱髓鞘），而桂枝茯苓丸组小鼠髓鞘脱失较轻（P＜0.05）。结果见图3。

图3 对EAE小鼠脊髓炎性细胞浸润和髓鞘脱失的影响

2.4 对EAE小鼠炎性因子TNF-α和IL-6含量的影响

桂枝茯苓丸组脾细胞培养上清液中TNF-α、IL-6浓度明显低于EAE模型组，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。表明桂枝茯苓丸可有效抑制EAE小鼠外周免疫炎症反应。结果见图4。

图4 对EAE小鼠炎性因子TNF-α和IL-6含量的影响

3 讨论

桂枝茯苓丸出自《金匮要略》，临床上桂枝茯苓丸用于瘀阻脉络的神经系统疾病疗效显著［3-4］。本研究结果表明桂枝茯苓丸可延迟EAE小鼠的发病时间，减轻临床症状，尤其是桂枝茯苓丸中剂量组效果更为明显。

MS/EAE病理过程的重要环节是炎性细胞大量浸润造成中枢组织破坏，出现髓鞘脱失。T淋巴细胞中枢浸润是诱发MS/EAE免疫病理过程的重要因素，活化的T淋巴细胞在CNS抗原递呈细胞作用下引起免疫炎症反应放大，形成中枢炎性微环境［10］，造成少突胶质细胞修复不足等。实验结果HE染色显示，桂枝茯苓丸可有效减少炎性细胞向CNS迁移和聚集，进而减轻髓鞘脱失。

在MS发病过程中，TNF-α为病变的促发因子，可诱导多种黏附分子、趋化因子、细胞因子（如IL-1，IL-6）等分泌，促进炎性介导物释放、活化巨噬细胞等。IL-6是一种强有力的促炎性细胞因子，对病原体的宿主防御和急性应激起着举足轻重的作用。促炎因子TNF-α、IL-6等由Th1细胞分泌，这类促炎因子介导少突胶质细胞损伤，诱导髓鞘降解，启动炎性反应［11-13］。本实验结果表明，桂枝茯苓丸可能通过抑制炎性因子分泌减轻炎性反应，调节机体免疫应答。

本实验结果表明，桂枝茯苓丸可延缓EAE发病时间、改善EAE神经功能评分、减少EAE小鼠体重丢失、减轻病灶的炎性细胞浸润，其机制可能与降低炎性因子分泌，调节机体免疫有关。这为进一步探索桂枝茯苓丸的抗炎、调节免疫功能提供了研究基础，也为临床应用桂枝茯苓丸通调阴阳，活血化瘀治疗MS提供了实验基础。