一种野生羊肚菌的驯化栽培研究*

贺国强，魏金康，吴尚军，胡晓艳，赵海康，邓德江

（北京市农业技术推广站，北京100029）

羊肚菌属（Morchella） 是一类珍稀且美味的食（药）用菌，羊肚菌的人工栽培受到全球广泛关注。法国最早开展羊肚菌的驯化栽培研究[1-2]。1982年美国的Ron Ower等[3]首次获得了室内栽培的羊肚菌子实体，随后美国进行了数年的羊肚菌产业化工厂栽培，但均以失败告终。上世纪80年代我国开始羊肚菌的相关研究，于90年代成功实现了人工栽培羊肚菌，并开创了羊肚菌大田栽培模式[4-6]，对于羊肚菌产业化具有重要意义。自2012年我国羊肚菌进入了产业化时期以来，栽培由最初的2.0×106m2，迅速增长到了2016年的2.3×107m2[7]。

羊肚菌的品种选育对于栽培开发至关重要。目前已知羊肚菌属有61个种，东亚或中国分布了该属近一半的物种（30种），欧洲分布有23种，北美分布有19种[8]。根据形态学的特征如菌盖近中部与菌柄是否分离、菌盖边缘是否明显向外伸展、菌盖的形状和颜色、盖表棱纹排列和凹坑的深浅等，羊肚菌属被分为3个大类：黑色羊肚菌类、黄色羊肚菌类和半开羊肚菌类；但是基于LSU、ef1-α、rpb1和rpb2四个基因的核苷酸序列系统发育分析，发现羊肚菌属可划分为黄色羊肚菌支系（Esculenta Clade）、黑色羊肚菌支系（Elata Clade） 和变红羊肚菌支系（Rufobrunnea Clade）[9-11]。部分黑色种类的羊肚菌如梯纹羊肚菌（M.importuna）、六妹羊肚菌（M.sexte－lata）、七妹羊肚菌（M.septimelata）、尖顶羊肚菌（M.conica）、羊肚菌（M.esculenta） 已成功驯化栽培，其中商业化栽培主要以梯纹羊肚菌、六妹羊肚菌、七妹羊肚菌为主[12-15]。

开展野生羊肚菌的采集和收集，积累了不少种质资源，通过对羊肚菌菌株（羊CP）的菌丝生物学特性和子实体农艺性状进行研究，驯化栽培优质资源，以期为商业开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

野生羊肚菌子实体于2014年采集自北京市昌平区延寿镇黑山寨（北纬N40°21′11.99″， 东经E116°17′47.68″）。经组织分离获得纯培养菌丝体，菌株命名为羊CP，由北京市农业技术推广站食用菌试验室保藏（馆藏编号：BJAESF201401）。经ITS序列鉴定，结合Blast在线比对（98%），结果表明菌株羊CP是欧氏羊肚菌 Morchella owneri X.H.Du，MycoBank登录号为 MB828952[16]。

1.2 培养基

菌株的分离与保藏，采用马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基。菌丝最适培养条件研究，采用基础培养基和加富培养基[17]。

1.3 菌丝体培养条件

1.3.1 温度试验

用已灭菌打孔器（直径6 mm）均匀截取已活化的菌丝体块，并接种于基础培养基，分别于5℃、10℃、15℃、20℃、25℃和30℃恒温避光培养，每个处理设置3个重复，培养7 d后观察记录。

1.3.2 pH试验

采用精密pH试纸，用10%氢氧化钠和10%盐酸在超净工作台中调节灭菌后的基础培养基pH，调节后的培养基pH分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，每个pH设置3个重复，接种后25℃避光培养7 d，观察记录。

1.3.3 碳源试验

以基础培养基中20 g葡萄糖的含碳量为标准，分别以相等含碳量的蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、乳糖代替基础培养基中的葡萄糖，其他成分同基础培养基。每个处理3次重复，接种后25℃避光培养7 d，观察记录。

1.3.4 氮源试验

以基础培养基中2 g蛋白胨的含氮量为标准，分别以相等含氮量的酵母粉、氯化铵、硝酸铵、黄豆粉、麸皮代替基础培养基中的蛋白胨。其他成分同基础培养基，每个处理3次重复，接种后25℃避光培养7 d，观察记录。

1.3.5 菌丝日均生长速度测定

以同批试验中菌丝生长最快的菌落为标准，最快菌落的菌丝将近长满90 mm平皿而未满时作为测量终点，对其他菌落同时进行测量。最后取3个测量数据的平均值。日均生长速度（V，cm·d-1）的计算公式为：

式中：R2为最后1次测量菌落半径（cm）；R1为第1次测量菌落半径（cm）；D为菌落培养天数（d）。

1.4 驯化和栽培

1.4.1 栽培种制作

按照木屑65%、小麦30%、腐殖土3%、石膏1%、白灰1%，含水量60%的配方拌料，分别装入聚丙烯塑料袋（35.0 cm×16.5 cm）中，每袋装湿料1.0 kg。每袋接入1块原种菌种（大小1.0 cm×1.0 cm）。培养温度20℃，空气湿度60%，避光培养直至长满菌包。

1.4.2 播种与发菌

播种前将土面浇湿，待水渗入土壤不粘手时开始播种。在土面上铺撒灭菌后的基料。将羊肚菌栽培种从菌种瓶（袋）中挖出，揉碎成颗粒状，均匀撒在土层表面，然后使用微型旋耕机将土面旋耕1次。菌种用量为 0.6 kg·m-2～0.9 kg·m-2。按南北方向做畦床，床宽1.0 m，高15 cm，畦间沟宽0.4 m。播种后10 d～15 d，待菌丝长满畦面后开始产生分生孢子时，放置灭菌后的营养袋。营养袋内培养料的配方为稻壳69%、小麦30%和石灰1%。将营养袋纵向的1个面用钉板打20个～30个孔，使打孔面贴近地面。每平方米用3袋营养袋（折幅×长度=15 cm×35 cm）。

1.4.3 出菇

当羊肚菌发菌60 d后，畦面白色菌丝褪去，进入出菇期。撤掉外援营养袋，调节土壤含水量20%和温度10℃～12℃。羊肚菌分化原基后适当增强光照，温室内温度控制在15℃～20℃。保持空间环境的空气相对湿度在75%～80%，将光照强度控制在600 lx～800 lx。每天通风2次～4次，每次通风时间维持在30 min左右，使二氧化碳浓度控制在1 964 mg·m-3以内。出菇后，比较各品种羊肚菌子实体形态及栽培产量。

1.5 统计学分析

所有数据采用SPSS 20.0统计软件进行处理和分析。

2 结果与分析

2.1 不同碳源对菌丝体生长的影响

不同碳源对菌丝体生长的影响见图1、表1。

表1 碳源对羊CP（Morchella owneri）菌丝体生长速度影响Tab.1 Effect of Carbon sources on growth speed of Morchella owneri mycelium

如图1、表1所示，羊CP在不同碳源培养基中均能生长，但菌丝利用碳源能力不同，因而生长速率有差异。在不同碳源培养基上，羊CP菌丝生长速度最快为乳糖，其次为可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖，最慢的为麦芽糖。羊肚菌菌丝生长迅速，初期无色或浅白色，菌丝迅速长满平板，随着培养时间的延长，菌丝逐渐浓密并转为浅黄至黄褐色，并产生浅黄至棕黄色菌核。添加葡萄糖的培养基菌丝由白色最终变为浅黄色；添加蔗糖和乳糖培养基的菌丝由白色最终变为黄色；添加麦芽糖和可溶性淀粉培养基的菌丝由白色最终变为棕色。菌核产生量最大为葡萄糖、蔗糖，其次为可溶性淀粉、麦芽糖，最小的为乳糖。综合菌丝生长速度和菌核长势，羊CP菌丝生长最适的碳源为乳糖；产生菌核最适合的碳源为葡萄糖和蔗糖。

2.2 不同氮源对菌丝体生长的影响

不同氮源对菌丝体生长的影响见图2、表2。

表2 氮源对羊CP（Morchella owneri）菌丝体生长速度的影响Tab.2 Effect of nitrogen sources on growth speed of Morchella owneri mycelium

如图2、表2所示，羊CP在不同氮源培养基中均能生长。在不同氮源培养基上，羊CP菌丝生长速度最快为黄豆粉和蛋白胨，其次为酵母浸粉、硝酸铵、麸皮，最慢为氯化铵。羊肚菌菌丝生长迅速，初期无色或浅白色，菌丝迅速长满平板，随着培养时间的延长，菌丝逐渐浓密并转为浅黄色，并产生浅黄色菌核。添加蛋白胨和麸皮培养基的菌丝由白色最终变为浅棕色；添加酵母粉培养基的菌丝由白色最终变为浅黄色；添加黄豆粉培养基的菌丝由白色最终变为棕色；添加氯化铵和硝酸铵培养基的菌丝呈羽毛状，不变色。菌核产生量最大为蛋白胨和黄豆粉，其次为酵母粉，最小为麸皮、硝酸铵、氯化铵。综合菌丝生长速度和长势，羊CP菌丝生长的最适合氮源为黄豆粉和蛋白胨，菌核产生的最适氮源为酵母粉。

2.3 不同温度对菌丝体生长的影响

羊CP在不同温度培养基生长情况见图3、表3。

表3 不同温度对羊CP（Morchella owneri）菌丝体生长速度影响Tab.3 Effect of different temperatures on growth speed of Morchella owneri mycelium

由图3、表3可知，羊CP菌丝的生长温度范围为10℃～25℃，在5℃和30℃条件下均可萌发，但几乎不生长。菌丝生长速率依次为25℃＞20℃＞15℃＞10℃＞30℃和5℃。在20℃～25℃，羊肚菌菌丝生长迅速，初期无色或浅白色，菌丝迅速长满平板，随着培养时间的延长，菌丝逐渐浓密并转色，并产生菌核。随着培养温度的增高，菌丝由浅黄色很快变为浅棕色或棕色，表明老化速度加快。当菌丝成熟时开始产生菌核，不同温度条件下产生菌核的快慢和数量不同。菌核产生量依次为：25℃＞20℃＞15℃＞10℃。在5℃和30℃条件下，未产生菌核。综合菌丝生长和菌核产生情况，羊CP菌丝生长和菌核产生的最适合温度均为25℃。

2.4 不同pH对菌丝体生长的影响

羊CP在pH 4～pH 11均能生长，但菌丝在不同pH条件下生长情况差异较大，见图4、表4。

表4 不同pH对羊CP（Morchella owneri）菌丝体生长速度影响Tab.4 Effect of different temperatures on growth speed of Morchella owneri mycelium

由图4、表4可知，羊CP在不同pH培养基上菌丝生长速度最快为7.0和8.0，其次是6.0、9.0、10.0、11.0和5.0，最慢的为4.0。在不同pH条件下，羊肚菌菌丝生长迅速，初期无色或浅白色，菌丝迅速长满平板，随着培养时间的延长，菌丝逐渐浓密并转色，并产生菌核。随着pH的增加，菌丝颜色加深，至8.0达到最深，然后变后变浅。当pH为4.0、5.0、10.0、11.0时，菌丝变为浅黄色；当pH为7.0和9.0时，菌丝变为浅棕色；当pH为8.0时，菌丝变为棕色。菌核产生量最大的pH为7.0、8.0、9.0、6.0，其次是10.0和5.0，最小的为4.0。综合菌丝生长速度和长势，羊CP的最适pH为8.0。

2.5 羊CP与其他羊肚菌品种的栽培产量比较

在室温20℃、湿度60%的室内暗光培养条件下，栽培种20 d菌丝长满菌包。在日光温室内播种后，菌丝7 d可穿透土层，长满畦面。55 d～70 d，土面出现白色透明的圆斑状原基，5 d～8 d后发育成幼菇，15 d～20 d原基长大，此时采收第一潮菇。采收的栽培子实体高5 cm～8 cm，菌盖直径1.5 cm～2.1 cm，驯化栽培的羊CP子实体见图5，各品种羊肚菌菌株的子实体比较见图6。

由图6可知，相较其他栽培品种羊CP（子实体个头较小，其原基发生数量多，菇体生长的密度较高，密度最大处0.2 m2成菇数量超过500个，其与其他羊肚菌品种的栽培产量比较见表5。

表5 羊CP（Morchella owneri）与其他羊肚菌品种的栽培产量比较Tab.5 Average yields between Morchella owneri and other Morchella spp.strains

根据表5测产统计，羊CP的平均产量为1.235 kg·m-2，仅次于新驯化的品种HM、T2；较目前大规模生产使用的羊1（平均产量为0.880 kg·m-2）和羊4（平均产量为1.150 kg·m-2），产量分别提高40.34%、7.40%。此外，羊CP子囊果更接近于野生羊肚菌，肉质脆嫩，口感较好，具有一定开发价值。试验初步结果表明，羊CP具有在日光温室内栽培推广的价值。

3 结论与讨论

羊肚菌是一类具有重要经济价值和科研价值的食（药）用真菌。随着商业化人工栽培技术的成功，羊肚菌栽培大面积推广，因此近年来野生羊肚菌资源成为国内外的研究热点。

菌丝生长速度和长势受到营养和生长环境的影响，是选择优质菌株的重要指标之一[18]。不同菌株在不同培养条件下生长特性差异往往很大。羊CP可以利用葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、可溶性淀粉等作为碳源，最适碳源为乳糖。前人的研究也表明，羊肚菌（M.impoauna） A1菌株的最适碳源为甘露醇、阿拉伯糖和乳糖[19]，二者相一致。但不同种羊肚菌的最适碳源并不相同。羊肚菌（M.esculenta）最适碳源为可溶性淀粉[20-21]；对于尖顶羊肚菌，合适的碳源是蔗糖、淀粉、麦芽糖和葡萄糖[22-23]。

羊CP最适氮源为蛋白胨和黄豆粉，最适氮源蛋白胨与前人报道一致[19]。羊肚菌对氮源的利用情况也因种类不同有所差异。羊肚菌（M.esculenta）最适氮源为尿素、蛋白胨或硝酸铵，且因菌株不同存在差异[20-21]；对于尖顶羊肚菌，最适氮源是天冬氨酸、半光氨酸和亚硝酸钠[22]。

羊CP最适温度为25℃，与前人的研究一致[19,21,24-25]，与陈芳草的研究不同[23]。羊CP最适 pH为8.0，与龚燕川的研究一致[26]。谢放等[21]报道即使是同一个种羊肚菌的不同菌株，最适pH也不相同。野生条件下，羊肚菌经常发生于石灰性土壤和火烧地环境[27]。据此推测，羊肚菌菌丝生长最适pH多为近中性至偏碱性条件。

ITS鉴定是真菌分子鉴定的重要手段之一[28-29]。羊CP虽然经过ITS鉴定为欧氏羊肚菌（M.owneri），属于黑色羊肚菌系[16]，但其子实体形态特征与目前大规模栽培使用的梯棱羊肚菌存在差异。表现为子实体菌盖为灰褐色、尖锥形，纵棱排列较规则，呈波浪状弯曲，横棱不明显，凹坑稍浅，接近于野生羊肚菌的特征，表明羊CP有驯化为新栽培品种的可能。从栽培试验的鲜菇产量统计看，羊CP相较于目前商业化栽培的梯棱羊肚菌和六妹羊肚菌菌株的产量均有所提高。这也表明羊CP具备栽培推广的价值，但其稳产性和抗病性等特性需要进一步进行栽培试验。

综上，通过对采集自北京的1株野生羊肚菌羊CP进行菌丝培养条件研究和大田栽培试验，结果明确了其最适碳源、氮源、温度和最适pH，可为进一步研究驯化羊CP菌株提供参考。羊CP菌株栽培试验中，鲜菇产量达1.235 kg·m-2，子实体形态接近野生状态，肉质脆嫩，具有一定栽培推广价值。