局部给药途径对内耳耳蜗作用机制的研究

孙海丽 于湛 魏永祥*

1首都医科大学附属北京安贞医院耳鼻喉科（北京100029）2北京市心肺血管研究所上气道功能障碍相关心血管病重点实验室（北京100029）

近年来，内耳疾病如突发性耳聋、梅尼埃病、耳鸣、自身免疫性内耳疾病、感音神经性耳聋等的发病率显著增高，且呈现明显年轻化趋势[1]。这已成为一种日益严重的社会问题，严重影响患者的生活和工作质量。

糖皮质激素已成为应用于内耳疾病治疗的最广泛使用的药物，临床上将其列为治疗内耳疾病的一线方案。目前常见的给药途径有三种，即全身用药、鼓室内给药及耳后给药[2-5]。全身给药是目前临床上最常用的方式，但由于血-迷路屏障的阻挡，药物很难在内耳维持有效的治疗浓度。所以要维持内耳有效的治疗浓度，必须长期大量用药[6,7]。长期大剂量使用糖皮质激素可引起多种全身多种不良反应，如血压血糖升高、内分泌失调、电解质紊乱、消化性溃疡、骨质疏松、诱发或加重感染等[5,8]，而且全身给药仅有少量药物能够进入内耳，内耳有效药物浓度低，对疾病治疗效果有限，因此探索多种方式局部给药受到越来越多的重视。鼓室给药作为一种常见的局部给药方式，主要通过圆窗膜渗透进入内耳，内耳有效药物浓度高，但其为有创操作性检查，可引起疼痛、眩晕、鼓膜穿孔、中耳炎等并发症，且药物在内淋巴液中分解快，作用时间短、易分解，持续给药效果不稳定[9,10]。耳后注射给药可保证药物在内耳的有效浓度和作用时间，且在体循环中药物浓度较低，全身不良反应甚小，特别适用于糖尿病、高血压、消化性溃疡等患者[8]，常作为激素全身给药的补救治疗[11-13]。大量的临床研究集中于不同途径糖皮质激素给药治疗内耳疾病效果，但基础研究明显不足。目前，给药方案和给药途径的选择几乎完全基于经验，我们对药物在内耳中的渗透途径及作用部位的了解尚不清楚。

本研究在动物水平比较耳后给药和鼓室给药途径的不同，通过对注射亚甲蓝后在耳蜗及周围组织的分布进行观察，进一步探讨耳后给药和鼓室给药对内耳耳蜗作用靶点间的区别和作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

12只C57BL/6小鼠，20-25g，北京维通利华技术有限公司提供。实验动物饲养在标准环境下，SPF级，室内温度22-26℃，湿度为60%，有恒定的温度、湿度，12:12昼夜规律。按照给药途径不同随机分为2组:耳后注射组、鼓室给药组。每组各6只，水合氯醛(10%，3mg/kg，北京中科公司）腹腔注射麻醉,麻醉满意后,将动物四肢固定于实验台上,维持体温于37℃。

1.2 给药方法

耳后注射组:选择右侧耳后皮肤无毛处皮下注射亚甲蓝0.1ml。

鼓室给药组:于小鼠鼓膜前下象限鼓室注射亚甲蓝0.1ml。

亚甲蓝给药后2小时后解剖耳蜗及周围组织，在40倍体式显微镜（Olymplus SZ61）下观察耳蜗基底膜染色情况，并采集图像。

1.3 取材方法

亚甲蓝给药后2小时分别进行取材，水合氯醛(10%，3 mg/kg，北京中科公司）腹腔注射麻醉后，将动物四肢固定于操作台上，维持体温37℃。取头上脚下位侧俯卧，头部备皮后，碘伏消毒，手术器械术前经高温灭菌消毒。沿枕部正中切口切开皮肤及皮下组织，向下分离切开颅骨，暴露脑组织。用自制拉钩拉开切口，将脑组织拨向一侧，可见颅底结构，听泡位于颞骨及颅骨形成的三角区域内，分离并去除听泡外侧壁覆盖的软组织和筋膜，暴露听泡外侧壁(如图1B)；以上各组均沿听泡后外侧磨除骨壁，暴露镫骨动脉、圆窗龛、耳蜗外侧壁(如图1C)；用三棱针穿破耳蜗外侧壁骨质，再用细针穿破内壁软组织膜，可见少许血液和清亮的淋巴液流出，挑开蜗尖、前庭窗和蜗窗。

图1 正常小鼠中耳及内耳结构各图中红色箭头所指部位如下所示：A鼓膜；B听泡；C耳蜗Fig.1 Normal mouse structure of middle ear and inner ear.The red arrows in figure represented structure as follows：A tympanic membrane;B hearing bubble;C cochlea.

2 结果与分析

2.1 耳后注射组

耳后注射亚甲蓝后2小时后，亚甲蓝分布以耳蜗顶转最强，其次为中转，底转微弱。脑膜及小脑幕、第三脑室，至面神经耳蜗段、鼓室段均有亚甲蓝着色，提示耳蜗内基底膜、血管纹染色很可能为亚甲蓝通过神经鞘膜途径逆行性传导至面神经、蜗神经、前庭神经，进而进入耳蜗毛细胞（如图2）。耳后注射药物可能先通过组织渗透扩散进入神经鞘膜层，并沿着神经鞘膜向内耳逆行扩散，最终达到耳蜗顶回，作用于耳蜗顶回的基底膜上的毛细胞。耳后给药亚甲蓝优先进入耳蜗顶转，耳蜗顶回的基底膜接收低频区听力信号，这与临床上耳后注射糖皮质激素对低频听力下降型突发性聋有效的现象一致。

图2 耳后给药后颅内及耳内染色情况A颅底染色；B颞区染色；C听泡内面观；D亚甲蓝沿面神经鞘膜进入内耳；E基底膜顶回染色Fig.2 Intracranial and intracranial staining after ear administration.A Skull base staining;B Temporal region staining;C Inside view of the auditory vesicle;D Methylene blue staining along the facial nerve sheath into the inner ear;E Blue staining cochlear volvulus

2.2 鼓室给药组

鼓室内注射亚甲蓝后2小时，可见亚甲蓝可以进入耳蜗各回基底膜、血管纹蓝染，但染色强度底回最强、中回次之、顶回最弱，中回、顶回只是轻微染色，故我们推测亚甲蓝可能通过圆窗膜渗透入内耳，通过内淋巴液传导至耳蜗内基底膜的毛细胞（如图3）。亚甲蓝优先进入耳蜗底转，可能通过圆窗、前庭窗途径进入内淋巴液。鼓室给药并非所有药物均依靠圆窗膜渗透进入耳蜗，而是有另一部分药物通过前庭窗的韧带血管间隙进入耳蜗淋巴液而作用于内耳，这与以往Salt AN等学者研究的结果相一致[14]。鼓室给药亚甲蓝优先进入耳蜗底转，耳蜗底转的基底膜接收高频区听力信号，这与临床上观察到鼓室糖皮质激素给药对突发性聋高频听力下降患者有效的现象一致。

图3 鼓室给药后染色情况A鼓膜染色；B听泡内面观；C亚甲蓝沿面神经鞘进入内耳；D基底膜底回染色Fig.3 Staining after intratympanic administration.A Tympanic membrane staining;B Inside view of the auditory vesicle;C Methylene blue staining along the facial nerve sheath into the inner ear;D Lower returns staining

3 讨论

近年来，随着内耳疾病发病率明显增高，糖皮质激素已成为应用于内耳疾病治疗的最广泛使用的药物。由于内耳位于颞骨深部，解剖结构复杂，无法进行活体病理探查，且大多数内耳疾病病因尚不清楚，糖皮质激素治疗有一定盲目性[15,16]。近年的临床研究发现，糖皮质激素可能通过改善内耳微循环、减轻膜迷路积水、抑制免疫反应等机制作用于内耳，在早期内耳疾病的治疗中取得了一定的疗效[7,8,12]。但糖皮质激素给药方式存在很多不足，明确药物在内耳中的作用途径尤为重要，成为内耳疾病治疗的又一难题。

《突发性聋诊断和治疗指南（2015）》推荐糖皮质激素耳后给药可以作为全身给药的补救治疗[11]。诸多临床研究证实糖皮质激素耳后注射治疗低频下降型突发性聋效果更为显著，推荐其作为初始治疗[8,17,18]，而且临床数据显示耳后注射激素对于治疗顽固性低频感音神经性聋效果明显，长期疗效稳定[19,20]，因此《突发性聋诊断和治疗指南（2015）》推荐糖皮质激素耳后给药可以作为全身给药的补救治疗[11]。本实验研究表明，耳后注射亚甲蓝，药物优先进入耳蜗顶转基底膜、血管纹蓝染，这也为目前临床研究中发现的耳后注射在低频下降型感音神经性聋患者中的应用效果显著提供了理论依据。目前研究认为耳后给药进入内耳主要可能通过以下途径：内淋巴囊途径、解剖裂隙途径、体循环途径和茎乳动脉途径[8]。但我们发现耳后注射亚甲蓝后，脑膜及小脑幕、第三脑室，至面神经耳蜗段、鼓室段、耳蜗顶回的基底膜均有亚甲蓝着色，提示亚甲蓝可能通过神经鞘膜途径向内耳逆行扩散，最终达到耳蜗顶回，作用于耳蜗顶回的基底膜上的毛细胞。而这条途径还未见文献报道，对耳后给药进入内耳的具体途径做出了补充。耳蜗顶回的基底膜主要接收低频听力信号，这也为临床上观察到耳后给药对低中频型突发性聋有效的现象提供了理论佐证。

鼓室给药途径主要包括鼓膜穿刺、鼓膜置管、经咽鼓管鼓室导入等，这种方式给药的基础是圆窗膜的半通透性。既往文献表明，鼓室给药药物通过鼓室由圆窗吸收[21-23]，能有效避开血-迷路屏障，内耳局部药物保持较高的浓度和作用时间，体循环血药浓度低，与全身给药相比有较大优越性。但在本研究中我们发现鼓室给药并非所有药物均依靠圆窗膜渗透进入耳蜗，而是有另一部分药物通过前庭窗的韧带血管间隙进入耳蜗淋巴液而作用于内耳。鼓室给药后亚甲蓝优先进入耳蜗底转，故我们推测亚甲蓝可能通过圆膜渗透入内耳，通过内淋巴液传导至耳蜗底回的基底膜的毛细胞，为临床研究中发现的鼓室注射糖皮质激素在高频下降型感音神经性聋中的治疗效果显著提供了理论支持。

综上所述，我们发现耳后注射糖皮质激素可能通过神经鞘膜途径向内耳逆行扩散，最终达到耳蜗顶回，作用于耳蜗顶回的基底膜上的毛细胞；鼓室注射糖皮质激素可能通过圆膜渗透入内耳，通过内淋巴液传导至耳蜗底回基底膜的毛细胞。我们推测耳后注射和鼓室内注射糖皮质激素后，激素可有效渗透至整个耳蜗。糖皮质激素耳后注射对低中频下降型突发性聋治疗效果良好，全身副作用小[8,18]。鼓室内注射对高频下降型感音神经性聋患者的应用效果显著[23，24]。内淋巴液的流动在促进药物进入内耳的过程中发挥重要的作用，局部给药的同时，辅以鼓膜按摩，促进内淋巴液的流动，可进一步提高内耳药物作用的浓度。我们建议糖皮质激素耳后注射联合鼓室给药作为全频突发性聋的初始治疗，特别适用于高血压、糖尿病、胃溃疡等的突发性耳聋患者。

耳后给药联合鼓室给药治疗内耳疾病，具有操作简单、微创性特点，受血-迷路屏障干扰小，药物可有效渗透至内耳各个部位，与全身给药相比有较大优越性。我们通过研究不同给药途径进入内耳的作用部位的研究，期望为不同分型内耳疾病的精准化治疗提供指导，寻找安全和疗效显著的个性化治疗方案。