血游离DNA在COPD患者中的表达水平及价值

陈菲 张玲 徐小勇

慢性阻塞性肺疾病(慢阻肺，COPD)是严重威胁人群健康的呼吸系致残性疾病，发病率高，并发症多，造成沉重的社会经济负担。而慢阻肺急性加重(AECOPD)是导致患者住院、呼吸衰竭加重的主要原因，生活质量下降、肺功能下降、死亡率增加。临床上一些标志物如年龄、血气中PaCO2对判断和处理患者病情有很好的帮助，但缺乏足够的特异性。目前认为COPD是肺对外界刺激的异常炎症反应，因此一些炎症指标有望成判断病情的标志物。血游离DNA(cfDNA)是炎症反应时免疫细胞和凋亡细胞释放的DNA，与机体炎症水平有相关性，在脓毒症、肿瘤等方面有较多研究，但在COPD患者中研究较少。因此本实验拟检测COPD患者呼吸衰竭状态下血清游离DNA的表达水平，以及与临床指标的相关性。

资料与方法

一、患者资料

纳入2014年1月至2017年12月东部战区总医院呼吸与危重症医学科RICU收治AECOPD患者，纳入标准：(1)COPD诊断及分级符合，中华医学会呼吸病学分会COPD诊治指南[1]标准。慢阻肺急性加重是指患者以呼吸道症状加重特征的临床事件，其症状变化程度超过日常变异范围并导致药物治疗方案改变。(2)年龄超过18岁，无妊娠。排除标准：(1)患者有恶性肿瘤病史，或入院CT等影像学提示恶性肿瘤可能；急性冠脉综合征及其他系统明显的炎症；慢性肾功能不全；脑梗塞；(2)留取标本前给予静脉或口服激素；(3)入院前或出院后随访稳定期无肺功能检查或肺功能检查不能诊断COPD；(4)其他可区分的以阻塞性通气功能表现的疾病：支气管扩张，淋巴管肌瘤病(LAM)等；(5)不能取得知情同意者。同期选择门诊的年龄、性别配对健康体检者作为对照。

二、标本采集及检测

入院后立即留取静脉血，并在48h、出院后1-2月稳定期随访时(4周内无明显急性加重的迹象)，抽取静脉血10ml，置于非抗凝试管中。同时抽取同期门诊就诊稳定期COPD患者及对应健康体检者血液，3000 r/min离心15min。分离血清，一80℃保存。游离循环DNA分离提取试剂盒：EpiQuik Circulating Cell-Free DNA Isolation Kit，基于磁珠的分级筛，real-time PCR 检测cfDNA。同时双抗体免疫夹心法测定降钙素原(PCT)。

三、临床资料的收集

入院后同步收集患者一般临床资料，包括入院APACHEII评分，人口学资料，临床症状，血气分析，血常规、IL-6。患者吸氧/机械通气情况，治疗疗效及预后，并进行一年的随访资料，在稳定期门诊行肺功能检查。另收集门诊确诊COPD稳定期患者，记录患者的肺功能、COPD症状评分、前一年的急性发作次数，并进行随访一年，记录其后患者急性加重的次数。

四、统计学

结 果

一、患者的一般资料

2014年1月到2017年12月我科ICU收治的AECOPD患者合计116名，除外慢性肾功能不全、肿瘤、急性冠脉综合征等合并症及失访等患者，共纳入68例患者。男性51例(75.0%)，女性17例(25.0%)；年龄58-92岁，平均年龄74±5岁。另同期在门诊就诊的稳定期COPD患者共125例，排除存在上述基础疾病和不能随访到一年的患者，总共纳入82例，其中男性62例(75.6%)，女性20例(24.4%)。纳入健康体检者72例，男性53例(73.6%)，女性19例(26.4%)。

二、AECOPD的cfDNA、其他炎症指标的比较

1 对比AECOPD、COPD稳定期及正常对照组之间cfDNA、WBC、PCT及IL-6比较(见表1)。其中cfDNA在各组间比较均有统计学意义(P=0.003)，且炎症指标WBC、PCT及IL-6在AECOPD与COPD稳定期及AECOPD与正常对照组间比较有统计学意义(P=0.036,P=0.001,P=0.021)，而在COPD稳定期及正常对照组之间无统计学意义(P=0.672,P=0.921,P=0.089)。

表1 AECOPD患者在急性加重期时各项炎症指标明显高于患者的稳定期

2 AECOPD患者痰量与血清cfDNA的关系：AECOPD患者血清的cfDNA与其的每日痰液量有相关性，随着痰液的增多，血清的cfDNA也增加，且各组间比较有统计学意义(P=0.026)(见表2)。

表2 急性期患者痰液量与血清cfDNA关系

3 急性期患者常用临床指标与血cfDNA指标相关分析：纳入的68例患者中，分析其入院后cfD-NA与血气分析中氧合指数、PaCO2、入住ICU时APACHEII评分有无相关性(见图1)，可见cfDNA与血气分析中氧合指数间存在相关性(r=0.502，P<0.05)，而cfDNA与二氧化碳分压间无相关性(r=0.02，P=0.743),cfDNA与APACHEII评分有相关性(r=0.834，P<0.05)。

图1 AECOPD组患者cfDNA与氧合指数、PaCO2、APACHEII评分间相关性

三、稳定期COPD分组与血炎症指标的关系

1 通过患者的CAT评分和急性加重次数，把门诊随访患者分为ABCD组，结合患者血中炎症指标，稳定期患者血清cfDNA在各组间存在统计学差异(P=0.048)，而其他的常用炎症指标如WBC、PCT及IL-6之间无统计学差异(P=0.871,P=0.912,P=0.631)(见表3)。

表3 稳定期COPD患者分组与炎性指标的关系

2 稳定期COPD患者肺功能的与血炎症指标相关性分析

测定门诊COPD稳定期患者，结合血清炎性指标，随着患者阻塞性通气功能障碍越重，患者血清中cfDNA也明显增高，cfDNA在各组间有统计学意义(P=0.023)，而WBC及PCT在各组间无统计学意义(P=0.852,P=0.914)(见表4)。

表4 COPD稳定期肺功能分级与血清cfDNA的相关性

四、炎症指标与再次急性发作的相关性

门诊纳入的82例患者中，随访的一年中有44例发生了急性加重，需住院治疗。发生1次及以上的急性加重患者与非发生急性加重者在稳定期血炎症指标的对比，发现稳定期cfDNA高者更易发生急性加重(P=0.012)(见表5)。

表5 COPD稳定期炎症指标与再次发生急性加重相关性

五、ICU结局与血cfDNA相关分析

纳入的68例患者中，最终有54例患者存活，14例患者死亡，表6分析存活和死亡患者cfDNA及炎症指标WBC、PCT及IL-6之间相关性，发现cfDNA在存活组及死亡组患者间有统计学差异(P<0.05)，而炎症指标WBC、PCT及IL-6在两组间无统计学差异(P>0.05)(见表6)。

表6 ICU结局与患者血炎性指标的关系

讨 论

慢性阻塞性肺疾病是目前发病率和死亡率最高的疾病之一，在我国40岁及以上人群中，慢阻肺的患病率高达14%左右。COPD是一种气道和肺的异常炎症反应，许多炎性因子、炎症细胞参与了这种炎症，造成了气道持续性的气流受限，最终可出现呼吸衰竭。而AECOPD是各种刺激，最重要是感染导致炎症急性加重，是患者死亡、症状加重的重要原因。由此可见，炎症是COPD的核心。

cfDNA是存在于人体血液中一种非细胞状态的胞外DNA，血浆中的游离DNA多与蛋白相结合，少数是以游离片段的形式存在。cfDNA来源于已经死亡的细胞，因此它反映了细胞损伤的程度。目前cfDNA在肿瘤、衰老、脓毒症中有较多研究，是非常重要的肿瘤标志物和炎症因子，COPD中cfDNA作为一个新的生物标志物受到人们的关注[2]。我们的研究表明在COPD急性加重和COPD稳定期，血中cfDNA均有明显的升高，这与其他一些炎性标志物，如白细胞、CRP、PCT、IL-6等不同，血中增高的cfDNA似乎也再次证实了COPD患者体内存在持续的炎症反应[3]。COPD异常的炎症可出现多种细胞的损害，细胞的死亡、凋亡等增加，游离的DNA水平必然高于正常，而且COPD特别是急性加重，往往最终会出现呼吸衰竭、内皮细胞等组织细胞的损伤，进一步会使游离DNA水平的增加。这种持续的炎症反应中cfDNA不光是炎性的结果，甚至有可能参与到炎症的网络反应中[4-6]，从而有可能参与了COPD的致病机制。

cfDNA的不同水平可反应COPD的病情改变，而存在一定的临床意义。我们的研究表明，患者症状越重、肺功能分级越高，往往血中cfDNA的水平越高。患者症状重、肺功能差，体内的炎症反应可较重，同时加上缺氧、二氧化碳升高等情况，导致组织损害，cfDNA水平也高于症状较轻的患者[7-8]。在COPD急性加重期很多炎症指标与病情、肺功能相关，如C-reactive protein(CRP), IL-6, TNF-α等[9]，我们的研究也支持了这些炎性因子在AECOPD中的价值。但对于稳定期患者来说，这些炎症指标却不敏感，这也表明这些因子的升高更多是因为急性加重期感染、应急导致的机体炎症反应的价值，而不能反映COPD这种慢性非特异性炎症。在稳定期时，cfDNA水平也与COPD的病情有相关性，这需要进一步的研究来支持。

cfDNA具有一定的预后预测价值，我们的研究也表明cfDNA在反应患者病情危重程度的同时，还可对ICU的结局预后有一定的提示，在严重的COPD入住ICU患者，病死组的血清的cfDNA高于存活组，这些与其反应的炎症程度相关，特别是一些AECOPD患者因为感染失控，最终出现脓毒症，此时cfDNA明显高于非脓毒症患者[10]。另外，在稳定期患者血清的cfDNA对急性发作也有一定的预测价值，这和其他的炎性因子不同[11]，这或许与稳定期COPD时，血清cfDNA仍可能反应出COPD的持续炎症有关，但这方面仍有很大的空白需要研究。

总之，血清cfDNA是COPD的重要生物学标志物，可提示COPD的病情和预后。稳定期的血清cfDNA与COPD持续的炎症水平有关，对急性发作有一定的预测价值。