白方腐乳开盖后储藏过程中生物胺和理化指标的变化

马艳莉,席晓丽,李大伟,梁静静,丁玉峰,李素萍,王 颉,孙剑锋,*(1.南阳理工学院生物与化学工程学院,河南南阳 473004;.河北农业大学食品科技学院,河北保定 071000)

腐乳是以大豆为原料,经加工磨浆、制坯、培菌、发酵而成的调味制品[1],含有蛋白质、亚油酸、钙以及维生素B12等物质[2]。它营养丰富而且还能够起到抗氧化、降胆固醇、降血压的作用[3-4]。Wang等[5]研究发现腐乳中的多肽具有清除DPPH自由基的作用;杭梅等[6]用乙醇提取毛豆腐样品,并测定提取物的体外血管紧张素转换酶(ACE)抑制活性,发现毛豆腐发酵第5 d时,60%的乙醇提取物对ACE的抑制活性最高。腐乳按其颜色可分为红方、青方、白方以及各种花色腐乳,白方腐乳不添加着色剂且外表和内部均呈淡黄色[7]。因独特的风味和外观而深受大众喜爱。但腐乳中蛋白质和氨基酸含量丰富,容易发生生物胺累积现象,因而存在安全风险。

生物胺是一类具有生物活性的含氮低分子量有机化合物,按其结构可分为脂肪族、芳香族和杂环胺[8]。不同的食品在加工或贮藏过程中产生的生物胺种类和含量也不相同。葡萄酒中腐胺检出率最高,腐乳中生物胺主要有腐胺、β-苯乙胺、尸胺、酪胺、组胺及色胺等[9]。生物胺的合成需满足3个条件:食品中存在前体物质氨基酸;含有能分泌氨基酸脱羧酶的微生物;有利于微生物生长以及氨基酸脱羧酶发挥作用的环境[10]。少量生物胺可以促进机体正常活动,但过量摄入可能会引起中毒等问题,而且中毒程度因人而异。目前,一些国家和组织对部分食品中生物胺的含量制定了限量标准,如美国限定可食用鱼类中组胺的含量应低于50 mg/kg,我国限定可食用鱼类中组胺的含量为200～400 mg/kg[11]。

腐乳类似奶酪,具有可涂抹的奶油稠度和独特的味道,主要和米饭或馒头一起食用,是一道受欢迎的配菜[12]。目前,对腐乳的研究大部分集中在分析微生物多样性,优化加工条件以及营养价值和功能成分的挖掘等方面。但腐乳开盖后,通常不能一次性全部食用,需对其储藏,而对腐乳在不同储藏条件下生物胺含量变化规律的研究较少。本研究以开盖的白方腐乳为实验材料,对其在不同储藏条件下生物胺和理化指标的变化进行分析。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

白方腐乳(生产日期2019年11月3日) 2019年11月15日购于河北省保定市当地商场,并当天进行实验;丹磺酰氯 纯度≥98%,上海麦克林试剂有限公司;乙腈 色谱级,上海Merck试剂有限公司;腐胺、色胺、组胺、苯乙胺、精胺、酪胺、尸胺和亚精胺 纯度≥97%,美国Sigma-Aldrich试剂有限公司;氨水、碳酸氢钠、氢氧化钠、丙酮、浓盐酸(37%)、甲醛(38%)和乙酸铵 分析试剂,天津市天力化学试剂有限公司。

CP214电子分析天平 奥斯豪仪器上海有限公司;2695型高效液相色谱仪 美国Waters仪器有限公司;Eclipse XDB-C18液相色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm) 美国Agilent仪器有限公司;STARTER2100酸度计 宁波新芝生物科技有限公司;Novasina CH-8533水分活度测定仪 瑞士步琦有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 白方腐乳处理方法 将从超市购买的8瓶同一生产日期白方腐乳开盖后,在不同温度条件下(4、15、25和35 ℃)各放置2瓶,储藏0、15、30、45和60 d后,取样测定其生物胺含量和理化指标。

1.2.2 生物胺的测定 生物胺含量按照李大伟等[13]的方法进行测定。具体方法如下:在5 mL试管中依次加入1 mL待衍生样品、200 μL氢氧化钠溶液(2 mol/L)、300 μL饱和碳酸氢钠溶液、1 mL丹磺酰氯溶液(10 mg/mL),涡旋1 min,混匀后置于42 ℃恒温水浴中并在暗黑条件下衍生45 min,取出,加100 μL氨水避光反应30 min后,用乙腈定容至5 mL最后,有机膜过滤(0.45 μm)后用于高效液相色谱分析。色谱条件:色谱柱为Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),柱温40 ℃,流速1 mL/min,进样量20 μL,紫外检测波长254 nm,流动相A为0.1 mol/L的乙酸铵,流动相B为乙腈。

1.2.3 理化指标的测定

1.2.3.1 水分活度的测定 水分活度(Water activity,Aw)用水分活度仪进行测定,同一样品重复测定3次。

1.2.3.2 pH的测定 pH的测定参照刘振锋[14]的方法。

1.2.3.3 氨基态氮的测定 氨基态氮(Amino acid nitrogen,FAAN)含量按照SB/T 10170-2007的方法进行测定。

1.3 数据处理

数据用SPSS 22.0分析显著性,实验结果由平均值±标准偏差表示,P<0.05表示差异显著。用SPSS 22.0对生物胺含量和理化指标作Pearson相关性分析。绘图使用Origin 8.6。

2 结果与分析

2.1 不同温度下白方腐乳中生物胺组成及含量的动态变化

不同温度条件下(4、15、25和35 ℃)开盖白方腐乳储藏过程中生物胺的变化如表1所示。在4 ℃储藏期间,白方腐乳中色胺、腐胺、组胺、酪胺、精胺和亚精胺储藏至第15 d时含量达到最大,此时,总胺含量最高为835.51 mg/kg,其中亚精胺、色胺和组胺的含量增加较大,共占总胺含量约68.92%;苯乙胺和尸胺贮藏至第45 d时含量达到最大,分别为39.83和75.57 mg/kg。在整个储藏过程中,总胺含量呈现先上升后下降的趋势。在15 ℃储藏期间,白方腐乳中尸胺的含量随着储藏时间的延长而升高,在第60 d达到最大值65.99 mg/kg;在整个储藏过程中,生物胺呈现出波动的趋势;酪胺、色胺、腐胺、亚精胺和精胺的含量均在第15 d达到最高,苯乙胺含量在第60 d达到最高,组胺含量在第30 d达到最大。在25 ℃下储藏,白方腐乳中色胺和酪胺含量在刚开盖时最高,二者大体呈下降趋势;亚精胺在储藏至第60 d才检测到,总胺含量随着储藏时间的延长而增加,在第60 d时,占总胺比重较大的是组胺(43.16%)和亚精胺(27.96%)。在35 ℃下储藏,色胺、苯乙胺、尸胺、组胺和亚精胺的变化趋势大体与25 ℃下呈现的趋势一致。在第15 d组胺和酪胺含量突增,此时总胺含量也增高。

表1 开盖白方腐乳在不同储藏条件下生物胺含量的变化Table 1 Changes of biogenic amines in the opened sufu products under different storage conditions

综上所述,以美国食品药品监督管理局规定的限量标准为参照,总胺含量在安全范围内;在25和35 ℃贮藏的白方腐乳苯乙胺含量比4和15 ℃的要高,说明25和35 ℃下苯乙胺更容易累积;组胺在25和35 ℃含量增长较快;酪胺在35 ℃储藏至第15 d时,其含量超出建议标准,其余不同温度不同贮藏时间酪胺含量均<100 mg/kg。在贮藏期间腐胺和尸胺的含量较低,尽管二者对人体的毒性相对较弱,但在一定程度上可增强组胺与酪胺的中毒风险,主要是由于腐胺和尸胺可抑制组胺代谢酶与甲基转移酶的活性[15-16]。Bover等[17]在研究贮藏条件对发酵风干肠中生物胺含量的影响时发现,贮藏在4 ℃下比贮藏在19 ℃下生物胺含量低。由此可知,低温储藏对生物胺的累积有一定的抑制作用,因为低温处理在一定程度上可抑制部分微生物生长并降低氨基酸脱羧酶活性。

2.2 不同温度下白方腐乳中理化指标的变化

2.2.1 不同温度下水分活度(AW)的变化 水分活度能反映产品中潜在微生物对水分的可利用性,不同微生物生长所需的水分活度都有一定的阈值。不同温度条件下(4、15、25和35 ℃)开盖白方腐乳储藏过程中AW的变化如图1所示,AW在0.85～0.92之间。在贮藏过程中,4 ℃储藏的白方腐乳AW相对较低。在15、25、35 ℃下储藏的前15 d,AW均呈下降趋势,其中35 ℃下白方腐乳的AW下降速度最快。不同温度下储藏,开盖白方腐乳的AW均高于0.85,有利于微生物生长以及酶的分泌,可能会促进样品中生物胺的积累。

图1 白方腐乳开盖后不同贮藏温度条件下水分活度(Aw)的变化Fig.1 The change of water activity of opened sufu under different storage temperature

2.2.2 不同温度下pH的变化 pH能引起酶活性的改变,而氨基酸脱羧酶对生物胺的产生有较大影响。因此,pH可间接影响生物胺的合成。肖洪等[18]发现在低的pH环境下细菌为了抵抗外部酸性环境会产生更多的氨基酸脱羧酶。不同温度条件下(4、15、25和35 ℃)开盖白方腐乳储藏过程pH的变化如图2所示,pH均在5.4～6.8之间,4 ℃下白方腐乳的pH相对较低,且波动范围较小。当储藏至30～45 d,35 ℃下放置的白方腐乳样品pH呈现大幅度增加,其它温度下储藏的白方腐乳pH变化较小,这可能与样品中生物胺等碱性物质的含量有关。

图2 白方腐乳开盖后不同贮藏温度条件下pH的变化Fig.2 The change of pH of opened sufu under different storage temperature

2.2.3 不同温度下氨基态氮(FAAN)的变化 样品中各种氨基化合物所含氮的总量为氨基态氮含量,通过对氨基态氮的测定可以了解蛋白质的水解程度[19-20]。不同温度条件下开盖白方腐乳储藏过程中氨基态氮含量变化如图3所示。白方腐乳在4、15、25、和35 ℃贮藏时,氨基态氮含量达到的最大值分别为0.31、0.41、0.22、0.43 g/100 g。15 ℃贮藏的白方腐乳氨基态氮含量最高时,相应的总胺含量也达到最大。Lu等[21]将40份酱油样品分成氨基氮低含量、中含量和高含量组,结果发现在氨基氮含量高的样品中,生物胺的总含量普遍较高,而氨基氮含量低的酱油样品中,生物胺的总含量较低,说明氨基态氮含量与生物胺含量存在一定的正相关关系。

图3 白方腐乳开盖后不同贮藏温度条件下氨基态氮含量的变化Fig.3 The change of FAAN of opened sufu under different storage temperature

2.3 生物胺与理化指标的相关性分析

对生物胺与理化指标进行皮尔逊相关性分析,结果见表2。双变量分析结果表明,腐胺与精胺、亚精胺,苯乙胺与尸胺、组胺的相关性较高;尸胺与组胺相关性最高(r=0.824,P<0.01);苯乙胺与腐胺、精胺,酪胺与精胺呈显著正相关。这可能与菌株种类以及生物胺的转化相关。例如,腐胺在亚精胺合成酶的催化下形成亚精胺,亚精胺在精胺合成酶的作用下形成精胺[22]。此外,精氨酸会水解或脱羧成鸟氨酸或胍丁胺,因而是腐胺合成的重要前体物质。胍丁胺作为腐胺的起始底物,主要有胍丁胺酶路径和胍丁胺亚氨基路径,而菌株的种类决定了产生腐胺的具体路径[23]。pH与苯乙胺呈显著正相关,与其余生物胺之间呈弱相关;氨基态氮与苯乙胺、尸胺、组胺呈显著正相关。大多数研究发现氨基态氮与生物胺之间存在一定的正相关关系[24]。Andic等[25]发现含氮量较高的干酪样品中总胺含量也较高。

表2 生物胺与理化指标的相关性Table 2 Correlation between biogenic amines and physical and chemical indicators

3 结论

生物胺是影响腐乳品质和食用安全的重要因素,其含量可作为评价食品质量安全的重要指标之一。本研究采用柱前衍生高效液相色谱分析开盖白方腐乳生物胺,结果表明,8种生物胺均有检出,总胺含量在151.11～835.51 mg/kg之间,未超过食品中生物胺的总含量建议值1000 mg/kg,但组胺含量超过100 mg/kg,这可能使白方腐乳存在潜在的中毒风险。通过对理化指标的分析,发现水分活度在0.85以上,超出病原体生长的安全界限,需要采取冷藏或其它措施。本研究为开盖的白方腐乳提供了基础数据,之后将进一步研究白方腐乳开盖后储藏过程中微生物和风味物质的变化,这可能有助于确定开盖腐乳的最佳食用期,以保证腐乳的食用口感和安全性。