茵陈蒿汤对非酒精性脂肪性肝病大鼠细胞色素氧化酶P450-2E1 影响研究

谭 婷，何 栋，朱红梅，何宜荣，艾碧琛

（湖南中医药大学中医学院，长沙 410000）

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是获得性代谢应激相关的肝脏疾病，指除却饮酒过量，包括其他原因形成肝损伤所致的肝细胞内脂肪沉积过多。NAFLD 的发生发展与家族遗传、生存环境、体内代谢，以及生活方式等诸多因素有关。NAFLD 的发病机制尚不完全明确，公认的是“二次打击”学说[1]。相关研究证实，细胞色素氧化酶 P450-2E1（CYP2E1）参与了NAFLD二次打击学说脂质过氧化反应、氧化应激、炎症反应的发生发展过程。本研究采用改良化高脂饮食建立NAFLD 大鼠实验模型，以茵陈蒿汤治疗NAFLD 大鼠，通过观察NAFLD 大鼠中CYP2E1 的表达，探讨茵陈蒿汤在NAFLD 中的治疗机制。

1 材料

1.1 实验动物与实验饲料 实验动物：50 只SPF 级雄性SD 大鼠[湖南中医药大学实验动物中心提供，合格证号：43004700030748，许可证号：SYXK（湘）2016-0002]，体质量：（200±20）g。实验饲料：普通饲料（湖南斯莱克景达实验动物公司提供），高脂饲料的组成为：基础饲料88%＋胆固醇2%＋猪油10%[2]。并且前期实验已造模成功[3]。

1.2 药物 茵陈蒿汤的组成及剂量：茵陈18 g，栀子12 g，大黄6 g（依据高等中医药学十二五规划的《方剂学》教材70 kg 成人临床剂量）。中药来源：芝林药业（长沙金荣誉峰）。中药制作：将所有药材加入蒸馏水浸泡0.5 h后，煎煮30 min，冷却后，用纱布过滤，用药量依据人与动物用药剂量的体表面积换算法进行计算[4]，配制成1.28 g/mL 浓度的药液。辛伐他汀来源：山东鑫齐药业有限公司，批号：20170508。同法将辛伐他汀的药物浓度配备成0.2 mg/L，并把所有药物保存在4 ℃冰箱备用。

1.3 主要仪器及试剂 实时定量PCR 仪（美国Bio-Rad CFX Connect），CYP2E1 逆转录试剂盒（promega A3500），Real-time PCR mix（Promega A6000），Trizo1 试剂盒（Invitrogen），引物由上海生工公司合成。

2 方法

2.1 造模分组和给药 50 只雄性SD 大鼠适应性喂养1周，采用随机法将大鼠分为空白对照组（n=15）和实验组（n=35）。实验动物房自然采光，相对湿度为30%～60%，温度保持在25 ℃左右，实验组大鼠予以造模，进行高脂饲料投喂，空白对照组大鼠用普通饲料投喂，自由取食饮水，喂养至第24 周末时，从2 组中各随机选取5 只大鼠，腹主动脉采血并处死，取出大鼠肝脏，病理切片，检测其是否成功造模。成功后，将实验组30 只大鼠随机分成3 组，每组10 只，分别是茵陈蒿汤组、SVT 组大鼠以及非酒精性脂肪肝组。喂养大鼠的过程，每周记录实验大鼠的体质量，观察其体型、精神状态及死亡情况。实验各组在成功造模后，每组大鼠按照1 mL/200 g 进行灌胃，给予对应的药物灌胃6 周。每天也用等容积的蒸馏水给非酒精性脂肪肝组和空白对照组灌胃1 次。

2.2 制备标本 6 周后，末次药物灌胃，提前禁食12 h，记录实验大鼠体质量，麻醉后进行腹主动脉采血，取出大鼠肝脏，冲洗氯化钠溶液后，称肝湿质量，计算肝指数。取肝右叶组织，切除一部分固定在10% 甲醛液中，剩余的部分保存在液氮内，放在-80 ℃冰箱里保存备用。全部血液标本保存在4 ℃环境下，2 h后在4 ℃下以2 000 r/min 离心10 min，完成后，取出血清，保存在-80 ℃冰箱中备用。

2.3 观察及指标检测方法 1）观察和称量计算观察肝脏形态，以及称量肝湿质量和计算肝指数（%）。肝指数（%）=肝湿质量/体质量×100%；2）采用全自动生化分析仪检测血清TC、TG、LDL-c；3）肝组织HE 染色且于光镜下观察形态学变化；4）使用PCR检测肝组织CYP2E1 基因表达：取肝组织，按Trizol试剂盒提供的方法提取RNA，利用Real-time PCR 仪自带软件MJ Opticon Monitor Analysis Software（Version 3.1） 收集数据并进行分析。见表1。

表1 β-actin、CYP2E1 引物信息

2.4 统计学方法 采用SPSS 22.0 统计分析数据，用均数±标准差（）表示计量资料，多组间比较采用单因素方差分析，不符合正态分布的数据，采用非参数检验秩和检验。以P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 基本情况 空白对照组的大鼠体型正常，毛色亮，神态佳，活动灵敏，饮食正常；非酒精性脂肪肝组的大鼠体型肥胖，毛色晦暗，精神及饮食不佳，活动灵敏度差。2 组大鼠均未死亡。

3.2 各组大鼠肝组织病理学表现 空白对照组肝细胞排列整齐，胞质均匀，大小一致，肝板肝窦清晰可见；非酒精性脂肪肝组中央静脉周围肝细胞肥大，胞质中可见空泡样变性，并有脂肪细胞浸润其中，中央静脉内皮细胞增生，内皮下有脂质沉积，可见炎性浸润及肝细胞坏死；SVT 组脂肪细胞消失，门管区周围肝细胞残存少量空泡样变，肝窦内可见胆汁淤积，少许炎性浸润；但茵陈蒿汤组肝细胞排列整齐，胞质中空泡变性消失，无脂肪空泡，内皮下无脂质沉积，肝细胞坏死和炎性浸润显现不明显。见图1。

图1 各大鼠肝组织病理变化（HE 染色，×100）

3.3 各组实验大鼠CYP2E1 相对表达量比较 见表2。

表2 各组实验大鼠CYP2E1 相对表达量比较（，n =10）

表2 各组实验大鼠CYP2E1 相对表达量比较（，n =10）

注：与空白对照组比较，# P ＜0.05；与非酒精性脂肪肝组比较，△P ＜0.05；与SVT 组比较，▲P ＜0.05

3.4 各组实验大鼠LDL-c、TC、TG 含量比较 见表3。

3.5 各组体质量及肝质量的比较 见表4。

表3 各组实验大鼠LDL-c、TC、TG 含量比较（，n =10） mmol/L

表3 各组实验大鼠LDL-c、TC、TG 含量比较（，n =10） mmol/L

注：与空白对照组比较，# P ＜0.05；与非酒精性脂肪肝组比较，△P ＜0.05；与SVT 组比较，▲P ＜0.05

表4 各组实验大鼠体质量、肝质量、肝指数比较（，n =10）

表4 各组实验大鼠体质量、肝质量、肝指数比较（，n =10）

注：与空白对照组比较，# P ＜0.05；与非酒精性脂肪肝组比较，△P ＜0.05；与SVT 组比较，▲P ＜0.05

4 讨论

NAFLD 是一种代谢应激性肝损伤，与遗传、胰岛素抵抗（IR）等密切相关[5]。“二次打击”学说作为现阶段NAFLD 公认的理论。第一次打击学说是指由于IR 引起的脂质积聚，致脂肪变性，引发肝脏损伤调节修复，在此基础上导致了第二次打击，第二次打击学说是指脂质过氧化反应、氧化应激、线粒体功能障碍以及炎症反应，导致肝脏出现炎症、纤维化，甚至坏死[6-7]。细胞色素氧化酶P450 是一类酶，是肝脏代谢主要的酶系之一，在内源性和外源性化合物中参与代谢，存在多种同工酶，CYP2E1 作为主要的一种，大部分分布于肝脏，在“二次打击”学说中，CYP2E1的诱导表达可加重肝内脂质代谢异常，且参与肝细胞的脂质过氧化、细胞凋亡、炎性因子形成以及星状细胞活化等过程，是参与氧化应激和脂质过氧化的关键酶[8]。KATHIRVEL 等[9]实验亦证实：CYP2E1 过度表达可导致氧化应激增强，糖原储备减少，并促进葡萄糖合成，增加脂肪堆积，减少肝脏中的胰岛素信号传导，增强胰岛素抵抗，并加重肝脏损害[10]。本研究结果亦表明，NAFLD 模型大鼠中肝组织中的CYP2E1 的表达增加，与对照组比较有显著差异，表明CYP2E1 参与了脂质过氧化及炎症反应，进而参与了NAFLD 的形成。

非酒精性脂肪性肝病在中医学中并无专用对应病名，根据其临床表现，把此病归为“肝癖”的范畴，其主要是由于外感湿邪，饮食不节，或脏腑亏损等诸多原因而发病，导致体内津液输布功能异常，聚湿生痰，久致肝郁脾虚，痰湿瘀积使血行不畅，渐至肝积[11]。茵陈蒿汤在《金匮要略·黄疸病脉证并治》篇中曰：“谷疸之为病，寒热不食，食即头眩，心胸不安，久久发黄为谷疸，茵陈蒿汤主之。”茵陈蒿汤由茵陈蒿、栀子、大黄组成，具有清热利湿退黄的功效，方中茵陈蒿清热祛湿退黄，栀子清热泻火，通利三焦，使湿热之邪从小便而出；大黄通利大便，使湿热之邪从大便而下，诸药配伍加强泻浊之功。研究[12]证实茵陈蒿汤在治疗非酒精性脂肪性肝病能取得满意疗效。现代药理研究[13]发现，茵陈蒿汤诸药合用具有改善血脂，抗氧化能力，降低组织炎症反应，保护肝细胞，从而治疗NAFLD。本研究结果显示，与非酒精性脂肪肝组比较，茵陈蒿汤组能够明显降低NAFLD 大鼠TC、TG、LDL-c 以及CYP2E1 的表达水平，前期实验[3]结果中显示，从肝组织的病理变化中发现，经过治疗后，在茵陈蒿汤组中，只存在少量脂肪空泡，病变组织显著减轻，肝细胞坏死和炎性浸润显现不明显。

综上所述，茵陈蒿汤能够减轻脂质异常代谢，降低组织炎症反应，改善肝功能，保护肝组织，对于治疗非酒精性脂肪性肝病有确切的临床疗效，且此实验为治疗NAFLD 提供了实验室依据。