甘氨酸和丙酮酸对于局部缺血再灌注后的全身性保护作用

王萌，傅钢兰，杨艳旗*

已有研究表明，肠系膜上动脉（superior mesenteric artery，SMA）缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）既可引起局部组织I/R 损伤，又能导致全身血流动力学恶化和非缺血的重要器官损害［1-5］。其机制与以趋化因子、细胞因子、血源性细胞等为介质的播散性炎症反应有关［6］。丙酮酸钠是每个活细胞的柠檬酸循环的中心化合物。在心、脑和肠缺血/再灌注损伤的实验研究中，丙酮酸的保护作用已被描述［7-10］。其保护效应的分子机制可能包括清除活性氧簇特别是过氧化物，通过再生还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）实现间接抗氧化功能，改善线粒体能量供应，降低胞浆氧化还原电位等［11］。甘氨酸是由还原型谷胱甘肽组成的氨基酸，已被报道在离体细胞、灌流器官和涉及心、肝、肾、肠和骨骼肌的体内模型中具有抗氧化和减轻 I/R 损伤的作用［1，2，4，5］。然而，在局部组织或器官I/R 导致的全身炎症状态和远隔器官（如心肺）受伤时，丙酮酸和甘氨酸是否有保护作用尚未完全清楚。在一些影响全身的疾病模型中，例如失血性休克［12，13］、脂多糖内毒素血症和盲肠结扎和穿孔的脓毒症模型中［14，15］，甘氨酸可以稳定血流动力学参数，减轻肺、肝及肾的损伤，并降低死亡率。但丙酮酸和甘氨酸在局部（如肠系膜）的缺血再灌注后是否也具有这种全身保护作用目前尚不清楚。

本研究中采用我们前期已经发表的可以监测血流动力学的动物模型［16］。其中使用超声血流测定仪（transit time flow measurement，TTFM）连续和实时监测射入大鼠主动脉的左心室的完整血流剖面，代表大鼠心输出量（CO），同时连续监测心输出量、平均动脉压（MAP）、肺动脉压（PAP）、中心静脉压（CVP）。根据这些记录的参数，可通过计算近似估计心脏指数（CI）、体循环阻力（SVR）和肺血管阻力（PVR）的大鼠CO、MAP、PAP 和CVP。在此模型基础上我们研究了丙酮酸和甘氨酸对SMA I/R 后局部损伤的影响，以及全身血流动力学和心脏、肺脏等重要脏器的保护作用。

1 材料与方法

异氟醚和氯胺酮（10%）（Ceva）、萘酚-D-氯乙酸酯酶试剂盒和邻二苯胺（Sigma Aldrich）、Portex导管（内径：0.58 mm，外径：0.96 mm，Smith Medical International）、丙酮酸、甘氨酸（Sigma-Aldrich）。实验方案由中山大学实验动物伦理委员会审查和批准。尽一切努力将实验动物痛苦降至最低。成年雄性 Sprague-Dawley（SD）大鼠，2～3 月龄，体重300～400 g，向中山大学动物实验中心采购，放于恒温（22±2℃）、12 h 明暗周期饲养，自由进食水。所有实验严格遵守中山大学动物伦理委员会管理执行。

麻醉、镇痛、手术和监护

监测方法按照我们此前描述后方法进行。概括来说，大鼠麻醉后用异氟醚（1.0%～1.5%，100%医用氧气，1.0 L/min）通气，右侧胸壁注入氯胺酮（80 mg/kg 体重）镇痛，体温维持在37°C。股动脉和股静脉插管监测MAP 和静脉输液。右颈静脉插管进行CVP 监测。气管插管，使用机械通气（UNO Micro Ventilator-03）。切开胸骨和心包，用显微器械仔细解剖胸腺、主动脉和肺动脉（PA）。经右心室动脉圆锥将硬膜外导管置入PA。连续记录MAP、CVP 和PAP。TTFM（Medistim，Oslo）探头置于大鼠主动脉开始监测血流。

根据平均动脉压（MAP）、中心静脉压（CVP）和体重（BW）按以下公式估算心脏指数（CI）、体循环阻力（SVR）。

肠系膜缺血再灌注方案按照以前描述进行［16］。在监测和通气建立后，正中切开腹腔，显露各组SMA。用血管夹夹闭SMA 并计时。阻断1.5 h（0～90 min）后开放，再灌注2 h（90～120 min）。再灌注前静脉注射丙酮酸50 mg/kg 或甘氨酸20 mg/kg（丙酮酸组6 例，甘氨酸组6 例）。丙酮酸和甘氨酸的用量根据以前的研究［5，8］确定。给药前将药物新鲜溶解于1 mL 林格液中，另一组给予纯林格液1 mL（林格组，n=6）。再灌注后，切除心脏处死动物。SMA 缺血前 30 min（T1）、缺血前 5 min（T2）、再灌注前5 min（T3）、再灌注后5 min（T4）和再灌注结束时（T5）分别于缺血前30 min（T1）、缺血前5 min（T2）、再灌注 5 min（T4）和再灌注结束时（T5）采动脉血（300 μL），测定血气分析和心肌标志物肌酸肌酶CK 及同工酶CKMB、超酶肌钙蛋白I（uscTnI）等。

然后对小肠和其他器官损伤进行评分/测定。心、肺、肝脏和小肠的组织水肿程度以湿干比衡量。完整的小肠，切除后等长切成10段。分别进行对于肉眼与显微评分。用萘酚-AS-D-氯乙酸酯酶染色法检测肠、肺、心、肝组织中性粒细胞浸润情况。

使用GraphPad Prism（版本7.0a）进行统计分析。用Shapiro-Wilk 检验验证连续变量的正态假设。差异计算采用单因素方差分析（ANOVA）、双因素方差分析和Dunnett 多重比较检验。组织学损伤评分采用Kruskal-Wallis 秩和Mann-WhitneyU检验。采用Bonferroni p 校正进行Mann-WhitneyU检验的多重比较。P＜0.05 为具有统计学差异。

2 结 果

2.1 血流动力学指标

假手术组在整个手术过程中血流动力学稳定。在不含丙酮酸或甘氨酸的情况下，林格组MAP 逐渐下降，但下降趋势无统计学意义（P＞0.05，图1）。丙酮酸组和甘氨酸组MAP 略有升高，上升趋势也不明显（P＞0.05）。经双因素方差分析，四组间无显著性差异（Time，F=1.33，P=0.15；Group，F=0.24，P=0.87）。假手术组CI 一直稳定到观察结束。林格组再灌注后CI 持续下降。观察结束时，林格组CI（145.16 mL/min·kg）明显低于假手术组（198.81 mL/min·kg，P＜0.01）。丙酮酸组、甘氨酸组和假手术组之间无统计学差异（P＞0.05）。四组的PAP 均维持在几乎平坦的曲线上，各组之间的多重比较显示没有显著性差异（P＞0.05）。关于CVP 指标，假手术组、林格组、丙酮酸组再灌注后中心静脉压稳定。林格组SVR 显著低于其它各组（P＜0.01）。

丙酮酸组、甘氨酸组复苏体积相比林格液组减少（P＜0.01，图2）。丙酮酸组与甘氨酸组比较差异无显著性。林格组再灌注早期液体复苏可维持CI，而再灌注约1 h 后加快输液仍出现CI 持续下降。

2.2 组织损伤程度

假手术组、林格组、丙酮酸组、甘氨酸组小肠肉眼评分分别为0（0）、3.75（1）、2.35（2）、2（2.5），（χ2=17.65，P=0.001，图3A）。经Mann-WhitneyU检验，林格组、丙酮酸组和甘氨酸组得分明显高于假手术组（U＜0.001，P=0.002）。虽然U检验显示林格与丙酮酸（U=4，P=0.026）、林格与甘氨酸（U=4，P=0.026）之间有显著性差异（P＜0.05），但经Bonferroni 校正后，差异不显著（P＞0.008）。镜下各组肠损伤评分分别为 0.25（0.25）、4.13（1.75）、2.75（0.75）、2.88（1.25）（χ2=19.76，P＜0.001）。多项比较发现，假手术组损伤评分低于其他3 组（U＜0.001，P=0.002）。丙酮酸组、甘氨酸组损伤评分低于林格组（U＜0.001，P=0.002）。浸润到肠组织的中性粒细胞呈粉红色或红色。经计数，假手术组、林格组、丙酮酸组、甘氨酸组分别为4.27±0.81/HPF、50.79±2.50/HPF、36.96±1.36/HPF、40±6.35/HPF。多重比较显示，假手术组中性粒细胞最少（P＜0.01），而林格组中性粒细胞明显多于丙酮酸组和甘氨酸组（P＜0.01，图3B，图4A-D）。

林格组心脏组织学检查显示中性粒细胞最多。部分切片在微血管纵切面可见中性粒细胞微血栓的征象。丙酮酸组和甘氨酸组中性粒细胞减少。这些中性粒细胞分布较散在。微血栓很少见（图4.M-P）。假手术组、林格组、丙酮酸组、甘氨酸组心肌中性粒细胞分别为3.56±0.84/HPF、18.56±1.58/HPF、12.44±1.33/HPF、14.11±1.52/HPF（P＜0.01）。丙酮酸和甘氨酸组中性粒细胞明显多于假手术组（P＜0.01）。林格组中性粒细胞明显多于丙酮酸组和甘氨酸组（P＜0.01）。中性粒细胞计数与小肠损伤和肺损伤评分都呈正相关（小肠，r=0.81，P＜0.01；肺r=0.57，P＜0.01）。

各组CK 均较基线值升高，可能与手术创伤有关（图5）。各组在差异无统计学意义。假手术组CKMB稳定在50 U/L左右，林格组、丙酮酸和甘氨酸组缺血再灌注后CKMB 上升至100 U/L 以上，明显高于假手术对照组（P＜0.01）。林格组CKMB 高达150 U/L以上，显著高于丙酮酸和甘氨酸组（P＜0.01）。假手术组肌钙蛋白（CKMB）稳定在50U/L 左右，低于其他各组（P＜0.01）。林格组CKMB 高达150 U/L以上，显著高于丙酮酸和甘氨酸组（P＜0.05）。林格组、丙酮酸组、甘氨酸组us-cTnI升高至1.0 ng/mL以上，显著高于假手术对照组（0.2 ng/mL，P＜0.01）。

肺组织学评分假手术组、林格组、丙酮酸组和甘氨酸组分别为 0.5（1）、4（2）、2.5（2）和 3（2）组，如图3 所示。假手术组损伤评分最低（U＜0.001，n=6，P=0.002）。林格组与丙酮酸组（U=8，n=6，P=0.132）、林格组与甘氨酸组（U=7.5，n=6，P=0.093）、丙酮酸+甘氨酸组（U=15.5，n=6，P=0.699）之间差异无统计学意义。假手术组、林格组、丙酮酸组、甘氨酸组中性粒细胞分别为3.67±1.5/HPF、17.0±7.97/HPF、12.33±1.58/HPF、13.33±1.76/HPF（P=0.002）。假手术组中性粒细胞明显低于其他各组（P＜0.05），但林格组与丙酮酸组和甘氨酸组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

肝脏中性粒细胞计数假手术组9.5±0.72/10 HPF，林格组 30.0±1.81/10 HPF，丙酮酸组 19.17±1.83/10 HPF，甘氨酸组18.5±1.43/10HPF（P＜0.01）。方差均匀度检验（Levene 统计量1.94，P=0.16）。丙酮酸和甘氨酸组中性粒细胞数明显高于假手术组（P＜0.01），但低于林格组（P＜0.01）。

2.3 组织水肿程度

林格组小肠和肺组织的水/干重比（9.87±0.83）显著高于其他各组（P＜0.01）。假手术组（4.04±0.26）、丙酮酸组（6.12±1.12）和甘氨酸组（5.42±0.32）之间无显著性差异（P＞0.05）。心脏和肝脏的水肿率在4 组间均无显著性差异（P＞0.05）。

2.4 呼吸和代谢性酸碱状态

各组气管插管通气后氧分压均下降，观察期内进一步下降，但组间比较差异无显著性（P＞0.05，图5）。林格组再灌注后代谢性酸中毒最为严重，pH、碱剩余均降低显著（P＜0.01）。

3 讨 论

本研究采用可监测 SMA I/R 后 CI、MAP、PAP等指标的动物模型，研究了丙酮酸和甘氨酸对SMA I/R 后血流动力学的保护作用。结果表明，丙酮酸和甘氨酸均能稳定SMA I/R 后血流动力学参数，减轻低血容量性休克的影响。组织学分析表明，丙酮酸和甘氨酸均能减轻SMA I/R 后局部和远隔器官的损伤。缺血再灌注损伤涉及细胞内过程和周围组织的炎症反应［6，17］。在缺血期，缺氧和能量耗竭引起的细胞损伤是主要的致病事件。能量负债引起细胞内钠、钙稳态的紊乱，水解酶的激活，细胞内膜和质膜通透性的增加，进而导致功能改变和细胞死亡。受损、死亡的细胞以及细胞碎片是炎症反应的触发因素，表现为粒细胞、巨噬细胞、补体系统和凝血系统的激活，活性氧（ROS）的形成和微血管灌注的障碍。在再灌注阶段，过量的ROS 形成导致额外的细胞损伤，由异常的线粒体膜复合体驱动的电子回流，或者由于微血管灌注受损导致的仍然缺氧［18］。

我们在前期研究中建立了新的可持续监测血流动力学的大鼠模型［16］。我们首次在升主动脉上应用TTFM 探头，参照测量的主动脉流量估算CO。Cerqueira 等人的另一项研究3 中，作者还报道了使用血流传感器测量肾上腹主动脉和肠系膜上动脉流量后肠系膜灌注不良后的血流动力学变化，但该方法无法获得灌注上半身的流量。因此，我们的CO 平均值远远高于Cerqueira 研究中记录的腹部血流量。实际上，我们相互验证了对方的结果，测量值在正确的范围内。根据文献所报道的CO 水平，我们对大鼠的剂量约为100 mL/min，而在巴西的Cerqueira 等人研究中，基线是20 mL/min。因此，将升主动脉血流视为CO 的近似值更为合理。我们以往的研究证实，SMA I/R 后，由于血管内容量的重新分配，导致低血容量性休克，表现为严重的脏器水肿和大量浆液性积液，同时MAP 和CI 降低。早期大容量复苏可有效逆转血流动力学恶化。但在晚期CI 和MAP 下降与复苏容量无关，提示心脏功能不全［16］。

在这项研究中，丙酮酸、甘氨酸在整个观察过程中通过容量复苏和MAP 促进CI 的维持。丙酮酸钠是最简单的α-酮酸，它能与过氧化氢酶反应，清除活性氧自由基，生成水和二氧化碳。它还可减轻中性粒细胞浸润和髓过氧化物酶［19］，恢复细胞内液氧化还原电位，通过抑制膜氧化降低丙二醛［20］。因此，丙酮酸钠在保护器官免受I/R 损伤的实验模型中得到了广泛的研究。然而，在小肠等初级器官I/R 后，丙酮酸对远隔器官如心、肺和肝的影响尚未被探讨。甘氨酸是最简单的氨基酸，是最早的抗I/R 损伤的细胞保护剂之一［18］。从那时起，在各种各样的实验模型中，甘氨酸已经被证明可以保护由于缺氧、活性氧、化学诱导的能量耗竭和仅仅是氧气补充而造成的I/R 相关损伤［1，19］，包括在原代细胞和细胞系、离体灌流器官或体内应用甘氨酸，甚至在肝移植［20］和心脏手术［21］的临床试验中。目前已知其保护机制包括依赖甘氨酸受体的直接细胞保护、依赖其还原型谷胱甘肽而抑制活性氧簇、以及抑制炎症介质和趋化反应等［19］。既往研究还探讨了合适的剂量范围和给药途径［5］。然而，甘氨酸对于局部肠道I/R 后的全身性效应也尚未阐明。

此外，使用丙酮酸、甘氨酸溶液时所需的复苏体积要小得多。丙酮酸和甘氨酸组的肠、心、肺水肿程度也比林格组轻。先前的研究表明，丙酮酸可以稳定生物膜系统，减少丙二醛的产生［20］。丙酮酸还可以稳定血管平滑肌张力［22］。而甘氨酸预处理增加的细胞谷胱甘肽可能有助于其保护膜免受脂质过氧化的伤害功能［25］。因此，推测丙酮酸和甘氨酸可抑制微循环通透性改变，防止血管内容量重分布。然而，还需要更多实验来验证此假设。

中性粒细胞活化在I/R 损伤的病理过程中起重要作用。SMA I/R 后中性粒细胞计数与肠损伤与肺损伤评分呈正相关。心脏HE 染色切片光镜下未见明显的形态学改变。但萘酚-ASD 氯乙酸酯酶染色也显示中性粒细胞在浸润心肌和滞塞微血管。而丙酮酸和甘氨酸可显著降低肠、心、肺、肝的损伤评分、水肿比率和中性粒细胞数量。这些结果表明丙酮酸和甘氨酸不仅对局部I/R 组织有益，而且对循环血流动力学状态以及心肺等重要器官也具保护作用。

综上所述，我们发现酮酸和甘氨酸可改善肠系膜缺血再灌注的血流动力学指标，既可以减轻局部组织的缺血再灌注损伤，又有利于改善休克状态的复苏效果，维持更好的心肺功能。