长链非编码RNA Linc00658在结直肠癌中的表达及其与西妥昔单抗抵抗的关系

张智勇，裘丰

（宁波医疗中心李惠利医院东部院区 胃肠外科，浙江 宁波 315040）

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是全球发病率、病死率均较高的恶性肿瘤[1]。表皮生长因子受体（epithelial growth factor receptor，EGFR）是上皮肿瘤中最重要的原癌基因之一，72%～89%的CRC组织中存在EGFR的高表达[2]。西妥昔单抗（Cetuximab）通过与EGFR内源性配体竞争性结合，阻断下游酪氨酸激酶的激活，进而发挥抗肿瘤作用，是晚期CRC的一线治疗药物，但患者均易发生西妥昔单抗继发性耐药，找到发生耐药的机制对 于临床治疗方案具有重要的指导意义。抑癌基因PTEN的丢失是导致CRC对西妥昔单抗耐药的重要因素[3]，但其丢失的机制仍有待揭示。非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）作为机体内广泛表达的表观调控因子，参与多种生物学过程，包括肿瘤的发生发展[4-5]。本研究通过生物信息分析发现长链非编码RNA（long non-coding RNA，LncRNA）Linc00658 可能通过micro RNA-19a-3p（miR-19a-3p）调控PTEN的表达，进而影响CRC细胞西妥昔单抗的敏感性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞：人肾上皮细胞293T、人CRC细胞CaCo2（美国ATCC）。

1.1.2 试剂：Cetuximab（美国Selleck公司），DMEM、RPMI-1640培养基及FBS（美国Gibco公司），DMSO、双抗及CCK-8试剂（美国Sigma-Aldrich公司），miRNA Control及miR-19a-3p mimic（上海汉恒生物公司），Linc00658过表达载体及Vector对照载体（上海吉凯基因公司），Lipofectamine 2000（美国Thermo Fisher公司），PTEN、磷酸化AKT（p-AKT）及磷酸化mTOR（p-mTOR）抗体（美国Cell Signaling Technology公司），TRIzoL及SuperScript IV反转录试剂盒（美国Invitrogen公司），SYBR Green（美国MedChemExpress公司），Passive Lysis Buffer、Luciferase Assay Reaget、pGL3-basic Vector（美国Promega公司）。

1.1.3 仪器：iMark酶标仪、ChemiDoc XRS+化学发光成像仪（美国Bio-Rad公司），7500荧光定量PCR仪（美国ABI公司）。

1.2 方法

1.2.1 生物信息网站预测以PTEN为靶基因的miRNA及其潜在结合的LncRNA：使用Targetscan数据库及miRNA Cancer Association数据库联合预测与PTEN相互结合的miRNA，并采用LncBase v.2数据库分析与靶miRNA相互作用的LncRNA。

1.2.2 细胞培养及西妥昔单抗耐药的诱导[6]：采用RPMI-1640培养基+10% FBS培养CaCo2细胞，培养环境：37 ℃、5% CO2、饱和湿度。接种对数生长期的CaCo2细胞至10 cm细胞培养皿中，传代培养至4皿，随机平均分为对照组及抵抗组。抵抗组采用4、8、16、32、64、128及256 nmol/L浓度梯度西妥昔单抗持续处理CaCo2细胞，每组浓度处理7 d，待细胞呈对数生长再使用更高浓度处理，直至细胞在 256 nmol/L西妥昔单抗中生长状态良好；对照组采用等量的DMSO处理。

1.2.3 细胞转染：接种1孔对照组及2孔抵抗组细胞于6孔细胞培养板中，以7.5 μL脂质体Lipofectamine 2000与2 μg Linc00658过表达载体混合于无血清RPMI-1640培养基中，加入其中1孔抵抗组细胞中作为过表达组，另将15 μL脂质体与4 μg 对照载体混合于无血清RPMI-1640培养基中，平均分为2份分别加入对照组及另1孔抵抗组细胞中。 6 h后PBS洗细胞3次后RPMI-1640+10% FBS继续培养24 h。同样利用Lipofectamine 2000在CaCo2细胞中转染miR-19a-3p mimic及mimic NC作为本研究的mimic组及NC组。

1.2.4 CCK-8实验检测细胞西妥昔单抗的半数抑制浓度（IC50）：接种对数生长期对照组、抵抗组、过表达组细胞、mimic组及NC组细胞于96孔板中，接种浓度为1×103/孔，每组细胞设置8个浓度梯度×5个重复样本，12 h后更换含4、8、16、32、64、128、256及512 nmol/L西妥昔单抗的RPMI-1640+10% FBS处理48 h，10 μL CCK-8试剂加入待测样本中，避光培养4 h，检测450 nm吸光值，Graphpad Prism 8.0软件绘制拟合曲线并估计每组细胞IC50值。

1.2.5 qRT-PCR检测Linc00658、miR-19a-3p及PTEN mRNA表达：接种对数生长期的各组细胞于6孔板中，1 mL TRIzoL提取细胞总RNA，1 μg RNA进行反转录，其中miR-19a-3p RT-引物为特异性引物，序列为：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTG AGTCAGTTTT-3’，得到cDNA进行实时荧光定量PCR反应，引物如下：Linc00658上游（F）：5’-CGAGCAGCTCC ATCTACAGA-3’，下游（R）：5’-GCTGGGTGGTTCAAACTCA G-3’；miR-19a-3p上游（F）：5’-ACACTCCAGCTGGGTGTG CAAATCTATGCAA-3’，下游（R）为通用引物；PTEN上游（F）：5’-GGACGAACTGGTGTAATGATATG-3’，下游（R）： 5’-TCTACTGTTTTTGTGAAGTACAGC-3’；GAPDH上游（F）： 5’-TCTCTGCTCCTCCTGTTC-3’，下游（R）：5’-GTTGACTCC GACCTTCAC-3’。每组设置3个平行孔，GAPDH作为内 参，2（-△△CT）法计算各组细胞Linc00658、miR-19a-3p及PTEN mRNA相对表达水平。

1.2.6 Western blot检测PTEN、p-AKT及p-mTOR蛋白表达：接种对数生长期的各组细胞于6孔板中，收集各组细胞总蛋白，以30 μg行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳2 h，转至PVDF膜1.5 h，10%脱脂牛奶室温孵育2 h，一抗4 ℃摇床孵育过夜，PBS洗膜3次，每次10 min，二抗室温孵育条带1.5 h，PBS洗膜3次，每次10 min，ECL化学发光液孵育条带，化学发

光成像系统对条带印迹进行曝光显影并拍照。

1.2.7 双荧光素酶报告基因检测Linc00658与miR-19a-3p的结合：将Linc00658构建至pGL3-basic载体上（长沙优宝生物公司），DMEM+10% FBS培养293T细胞，接种至6孔板中并分为Negative control（NC）组及mimic组，NC组共转染pGL3-basic-Linc00658及miRNA control，mimic组共转染pGL3-basic-Linc00658及miR-19a-3p mimic，48 h后收集细胞悬液，预冷PBS洗细胞3次，100 μL PBL裂解液室温孵育30 min，2组细胞各取10 μL上样至96孔板中，每组设置5个平行孔，加入100 μL预混Luciferase Assay Reagent II检测荧光强度为RLU1，加入100 μL 预混Stop & Glo Reagent检测荧光强度为RLU2，以RLU1/RLU2作为各组相对荧光强度。

1.2.8 双荧光素酶报告基因检测Linc00658对miR-19a-3p介导的PTEN抑制的影响：将PTEN 3’UTR区构建至pGL3-basic载体上，接种293T细胞至6孔板中并分为PTEN+NC+Vector（PNV）组、PTEN+mimic+ Vector（PMiV）组及PTEN+mimic+Linco0658（PMi58）组，PNV组转染pGL3-basic-PTEN、miRNA control及Vector；PMiV组转染pGL3-basic-PTEN、miR-19a-3pmimic及Vector；PMi58组转染pGL3-basic-PTEN、miR-19a-3p mimic及Linc00658过表达载体，方法同前。

1.3 统计学处理方法 采用Graphpad Prism 8.0软件。正态分布计量资料以±s表示，2组比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 过表达Linc00658可部分逆转CaCo2细胞对西妥昔单抗的耐药 与对照组比，抵抗组及过表达组在4～512 nmol/L西妥昔单抗处理时，细胞存活率显著增高（P＜0.01），通过曲线拟合法计算IC50，抵抗组及过表达组西妥昔单抗IC50均显著增高（P＜0.01）；而相比抵抗组，过表达组在32～512 nmol/L 西妥昔单抗处理时，细胞存活率显著降低（P＜0.01），通过曲线拟合法计算IC50，过表达组西妥昔单抗IC50显著降低（P＜0.05），见图1。

图1 3组细胞在不同浓度西妥昔单抗下的细胞存活率

2.2 miR-19a-3p mimic可促进CaCo2细胞对西妥昔单抗的抵抗 与NC组比，mimic组在8～512 nmol/L 西妥昔单抗处理时，细胞存活率显著增高（P＜0.01），通过曲线拟合法计算IC50，mimic组西妥昔单抗IC50显著增高（P＜0.01），见图2。

2.3 过表达Linc00658可抑制miR-19a-3p并上调PTEN mRNA的表达 qRT-PCR结果显示，相比对照组，抵抗组Linc00658及PTEN mRNA表达显著降低，miR-19a-3p表达显著增高（P＜0.01）；相比抵抗组，过表达组Linc00658及PTEN mRNA表达显著增高，miR-19a-3p表达显著降低（P＜0.01），见图3。

图2 NC及mimic组细胞在不同浓度西妥昔单抗下的细胞存活率

图3 各组细胞Linc00658、miR-19a-3p及PTEN mRNA相对表达量

2.4 过表达Linc00658可上调PTEN并抑制p-AKT及p-mTOR的蛋白表达 Western blot结果显示，与对照组比，抵抗组PTEN表达显著降低，p-AKT及p-mTOR蛋白表达显著增高（P＜0.05）；相比抵抗组，过表达组PTEN表达显著增高，p-AKT及p-mTOR蛋白表达显著降低（P＜0.05），见图4。

图4 各组细胞PTEN、p-AKT及p-mTOR的Western blot结果

2.5 miR-19a-3p可抑制Linc00658荧光素酶活性 LncBase数据库分析与miR-19a-3p具有潜在结合的LncRNA，结果显示miR-19a-3p与Linc00658转录本48～65位点以8mer的形式结合（见图5A），同时，相比NC组，mimic组荧光素酶活性显著降低（P＜0.01），见图5B。

2.6 Linc00658对PTEN荧光素酶活性的影响 TargetScan及miRcancer数据库联合分析与PTEN相互作用miRNA，发现miR-19a-3p与PTEN 3’UTR区411-417位点以7mer-m8的形式结合（见图6A），相比PNV组，PMiV组荧光素酶活性显著降低（P＜0.01）；相比PMiV组，PMi58组荧光素酶活性显著增高（P＜0.01），见图6B。

3 讨论

ncRNA作为分布广泛的表观遗传调控因子，参与机体绝大多数生物学过程。西妥昔单抗耐药的发生同样存在ncRNA的异常表达及调控，LU等[7]及THOMAS等[8]研究发现LncRNA miR100HG可协同miR-100和miR-125b介导Wnt/β-catenin通路的激活，进而促进CRC及头颈鳞癌细胞西妥昔单抗耐药；JING 等[9]及PENG等[10]发现LncRNA Linc00973可通过调控糖代谢促进西妥昔单抗耐药细胞株的恶性表型。另外，miR-204、miR-143、miR-145及miR-146a等均被发现通过不同途径参与影响肿瘤细胞西妥昔单抗耐 药[11-13]。

miR-19a-3p作为PTEN的上游负性调控因子，在多种恶性肿瘤中发挥促癌作用，包括骨肉瘤、胃癌、肝细胞癌及乳腺癌等[14-17]，其中，LI等[15]研究发现LncRNA SLC25A5-AS1可作为miR-19a-3p的内源竞争性RNA（competing endogenous RNAs，ceRNA），抑制其介导的PTEN丢失及胃癌细胞的恶性表型；miR-19a-3p在结直肠癌中同样也被发现可通过抑制FOXF2 mRNA水平，进而促进细胞上皮-间充质转化、侵袭、迁移和增殖能力[18]。考虑到PTEN的丢失是肿瘤细胞西妥昔单抗耐药的重要原因之一[19-20]， 同时，基于LncRNA与西妥昔单抗耐药的广泛联系，本研究首先通过生物信息技术在CRC细胞中预测到与miR-19a-3p潜在结合的LncRNA Linc00658，并观察到Linc00658及miR-19a-3p在西妥昔单抗抵抗的CRC细胞株中异常表达，提示两者可能存在相互作用并参与调控PTEN进而影响CRC细胞西妥昔单抗抵抗的形成。故我们在抵抗细胞中外源性过表达Linc00658，发现miR-19a-3p表达显著降低，而PTEN mRNA及蛋白表达均显著增高，其靶分子AKT及mTOR显著激活，同时抵抗细胞西妥昔单抗敏感性增高，表明Linc00658可能作为miR-19a-3p的ceRNA发挥表观调控作用，间接影响PTEN的表达，进而影响CRC细胞西妥昔单抗敏感性。进一步我们通过荧光素酶报告基因验证了Linc00658与miR-19a-3p存在显著结合，表明Linc00658同SLC25A5-AS1一样[15]，可作为miR-19a-3p的ceRNA发挥调控PTEN的作用。综上，Linc00658通过竞争性结合miR-19a-3p，促进CRC细胞PTEN的表达及西妥昔单抗的敏感性。我们将进一步通过构建突变体及体内实验证实上述推论，为相关药物靶点及标志物的开发提供依据。

图5 miR-19a-3p对Linc00658荧光素酶活性的影响

图6 Linc00658对PTEN荧光素酶活性的影响