猪血球蛋白营养分析与水解工艺优化及制备金属螯合肽的研究

孙子怡 杨剑婷 谢宁宁 张福生

(1. 安徽科技学院食品工程学院，安徽 滁州 239000；2. 安徽省农业科学院农产品加工研究所，安徽 合肥 230031)

微量元素补充剂能够有效预防此类缺乏症，其中，第1～3代补充剂分别为无机盐类、有机酸盐类和氨基酸螯合物[1]。此外，由金属螯合肽(Metal Chelating peptide, MCP)与金属离子配位结合生成的肽—金属螯合物，可以作为第4代补充剂的良好备选。相比较而言，其具有吸收效率高和无竞争性等优点[2]，是当下研究重点之一。

天然蛋白质的酶解工艺，既是获得金属螯合肽的关键技术手段之一，也是制备肽—金属螯合物的重要前提[3-5]。卢素珍等[4]以草鱼鱼鳞为原料，采用双酶法制备多肽，运用响应面法优化获得最佳酶解工艺，使酶解物的水解度得到显著提升，且具有65.72%的铁螯合活性。原洪等[5]以花椒籽蛋白为原料，通过单因素和Box-Behnken方法优化酶解工艺，获得最优酶解物的水解度和铁结合能力分别为7.23%和585.66 mg EDTA/g·蛋白质。王常瞵等[6]运用蚌肉为原料，以螯合率为指标，采用响应面法优化酶解工艺，制得蚌肉肽。

近年来，中国猪肉消费和生猪出栏量均为全球最大，其中，生猪年均出栏头数约6亿[7]。据估算[8]，每年可产生约3.0×105t优质猪血。猪血富含优质蛋白质，经预处理离心，可得到血浆液和血球液，分别占65%和35%左右[9]。课题组前期研究[10-11]表明，猪血和猪血浆均有制备优异金属螯合肽的潜力，可作为微量元素补充剂的良好载体。因此，有必要对猪血球制备金属螯合肽的酶解工艺进行优化，形成系统化的工艺技术集成。

研究拟以猪血血球蛋白为原料，检测其基本营养指标和氨基酸组成，再采用碱性蛋白酶进行酶解，以水解度为考察指标，优化血球蛋白肽的最佳工艺，评估血球蛋白肽的金属螯合能力，以期为猪血资源高值化利用提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

碱性蛋白酶：酶活≥2.4 U/g，合肥博美生物科技有限公司；

猪血：合肥万润食品有限公司；

盐酸、硝酸、高氯酸、硫酸、氢氧化钠、氯化亚铁、硫酸铁铵、硼酸钾、三硝基苯磺酸等：分析纯，国药集团化学试剂公司。

1.1.2 仪器与设备

双光束紫外可见分光光度计：1900PC型，上海谱元仪器有限公司；

pH计：PHS-3C型，上海仪电科学仪器有限公司；

冷冻干燥机：FD-1CE型，北京德天佑科技发展有限公司；

原子吸收光谱仪：iCE 3500型，美国赛默飞世尔公司；

酶标分析仪：HR801型，华科瑞科技有限公司；

全自动凯式定氮仪：L-8900型，丹麦福斯分析仪器公司；

电感耦合等离子体原子发射光谱(ICP-AES)：iCAP 7400型，赛默飞世尔科技公司。

1.2 方法

1.2.1 血球粉加工流程

猪血→离心分离(6 000 r/min、-4 ℃、15 min)→血球液→超滤(压力0.15 MPa，温度45 ℃)→喷雾干燥(进风温度150 ℃，排风温度105 ℃)→血球粉

1.2.2 血球蛋白粉酶解工艺 取规定量血球粉于规定体积去离子水中，溶解，调节pH值，加入规定比例碱性蛋白酶后，置于恒温水浴摇床进行规定条件的酶解反应。反应结束后，水解物于100 ℃水浴灭酶3～5 min。冷却至室温后，血球酶解液在-4 ℃、6 000 r/min条件下离心15 min，过滤，取上清液，随后真空冷冻干燥(-55 ℃，48 h)，制备血球蛋白肽。

1.2.3 基础理化检测

(1) 脂肪含量：按GB 5009.6—2016的索氏抽提法执行。

(2) 水分含量：按GB 5009.3—2010的直接干燥法执行。

(3) 蛋白质含量：按GB 5009.5—2016的凯氏定氮法执行。

1.2.4 氨基酸组成分析 取0.1 g样品于水解管中，加入10 mL的6 mol/L盐酸溶液，充氮气排净管中空气。置于110 ℃的烘箱反应22 h，再用超纯水将溶液定容至50 mL。取其反应液1 mL于烧杯中，真空干燥24 h，加入3 mL 0.2 mol/L的色谱纯HCl溶液，混匀后取1 mL经0.22 μm滤膜过滤，用氨基酸自动分析仪测定组分。

1.2.5 水解度(DH)测定 采用三硝基苯磺酸法(TNBS法)[12]。称取一定量样品，用去离子水稀释4倍，离心取10 μL上清液和100 μL硼酸钾(1 mol/L pH 9.2)加入96孔酶标板中，之后再加入40 μL TNBS (1.2 g/L)，于37.1 ℃培育1 h。采用酶标仪(405 nm)测量吸光值。

1.2.6 单因素试验

(1) pH值：水解时间4 h、水解温度50 ℃、底物添加量8%、酶与底物比(m酶∶m底物)1∶250，考察pH值(7.0，8.0，9.0，10.0，11.0)对猪血球蛋白水解物水解效果的影响。

(2) 底物添加量：水解时间4 h、水解温度50 ℃、酶与底物比(m酶∶m底物)1∶250、pH值9，考察底物添加量(4%，6%，8%，10%，12%)对水解效果的影响。

(3) 水解温度：水解时间4 h、底物添加量8%、酶与底物比(m酶∶m底物)1∶250、pH值9，考察水解温度(40，45，50，55，60 ℃)对水解效果的影响。

(4) 酶添加量：水解时间4 h、水解温度50 ℃、底物添加量8%、pH值9，考察碱性蛋白酶与底物比(m酶∶m底物)(1∶500，1∶250，1∶167，1∶125，1∶100)对水解效果的影响。

(5) 水解时间：水解温度50 ℃、底物添加量8%、酶与底物比(m酶∶m底物)1∶250、pH值9，考察水解时间(2，4，6，8，10 h)对水解效果的影响。

1.2.7 响应面试验 依据Box-Behnken中心组合试验设计和单因素试验结果，选取显著影响蛋白水解度的因素(水解时间、pH和温度)进行优化。

1.2.8 ICP-AES检测螯合活性 改进Wang等[13]的方法制备肽—金属螯合物。向5 mL蛋白质水解物(20 mg/mL)中添加1.0 mL ZnCl2(50 mg/mL)或FeCl2(50 mg/mL)或CuCl2(50 mg/mL)无机盐溶液，用0.5 mol/L NaOH和0.5 mol/L HCl调节pH值至6.0。30 ℃ 下反应45 min后在8 000× g下离心15 min，去除上清液，获得沉淀物。针对沉淀物，采用80%乙醇溶液复溶，漩涡混合后，8 000× g离心，取沉淀，反复操作3次，制得金属螯合物。空白组以1 mL蒸馏水代替ZnCl2或FeCl2或CuCl2溶液。GSH(20 mg/mL)和EDTA(5 mg/mL)作为阳性对照组。

参照Chope等[14]的方法，采用ICP-AES检测金属螯合物中铁、铜和锌的含量。分析条件：传动功率1 300 W；冷却气体流速15 L/min；辅助气体流速0.2 L/min；载气流速0.8 L/min；注射速度1.5 mL/min；波长206.20 nm；观察方法为轴位。

螯合率按式(1)计算：

R=[(C样品-C空白)/(C总-C空白)]×100%，

(1)

式中：

R——螯合率，%；

C样品、C空白、C总——分别是肽—金属螯合物、蛋白水解物、混合溶液(无机盐和蛋白水解物)的金属离子含量，μg/mL。

1.2.9 统计分析方法 采用SPSS 16.0的one-way (ANOVA)进行方差分析，试验数据取3个平行试验的平均值。采用Design Expert 8.0进行响应面工艺设计。

2 结果与分析

2.1 基本营养指标

对猪血及血球蛋白粉的基本营养指标进行分析比较，如表1所示。猪血水分含量为95.06%，脂肪含量较低。经分离后制备出的血球蛋白粉水分含量为7.34%，蛋白含量为91.60%。有报道[15]指出，猪血球蛋白具有优异的营养特征。团队前期研究[10-11]已经证明猪血和猪血浆中蛋白质是金属螯合肽的优异前体。因此，优异的猪血球蛋白可用于后续金属螯合肽的制备研究。

2.2 氨基酸组成分析

对猪血粉和血球蛋白粉的氨基酸组成及含量进行分析比较，结果见表2。两种蛋白粉的酸解产物中均检测出16种氨基酸，色氨酸受到破坏，未检出。猪血和血球蛋白中均检出7种必需氨基酸，其中亮氨酸、赖氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸含量丰富。这与赵治国等[16]报道的血球蛋白粉氨基酸组成特征类似。

2.3 单因素试验

2.3.1 pH值 由图1可知，水解度指标值随pH值的增大呈先增大后减小的趋势，与薛照辉等[17]报道菜籽蛋白酶解有关规律的变化趋势相似。当反应体系pH值>10时，蛋白酶在强碱性条件下空间构象发生改变，降低蛋白酶对底物的酶解效率，导致水解能力降低[18]。故最佳pH值为10。

表1 猪血和血球蛋白粉的基本营养指标

表2 猪血粉和猪血球蛋白粉的氨基酸组成分析†

图1 pH值对蛋白水解度的影响

2.3.2 底物浓度 由图2可知，当底物添加量为4%～8%时，水解度指标值随底物浓度的升高而略微增加，但不显著；当达到8%时，水解度达到最大，与殷俊峰等[11]研究猪血浆蛋白的水解度与底物浓度之间的关系有着相似的影响。这可能是因为部分酶没有与分离蛋白充分接触以及产物达到一定量时会对反应有抑制作用。因此，底物添加量应控制在8%左右。

图2 底物添加量对蛋白水解度的影响

2.3.3 水解温度 由图3可知，当水解温度<50 ℃时，水解度呈上升趋势；当水解温度>50 ℃时，水解度开始下降。陈树俊等[19]研究也表明在50 ℃时，酶解核桃粉的水解度达到最大。推测这是由于水解温度在达到蛋白酶的最佳温度之前，升高反应体系的温度将促进蛋白酶活性，而之后升温则会抑制其活性。因此，选择水解温度为50 ℃ 用于后续工艺优化。

2.3.4 酶添加量 由图4可知，水解度在酶与底物比(m酶∶m底物)为1∶500～1∶100内添加量呈上升趋势而后缓慢下降。这可能与酶本身也是一种蛋白质，当酶与底物比过大时对酶解过程造成干扰有关。因此，酶与底物比(m酶∶m底物)可选择1∶250。

2.3.5 水解时间 由图5可知，水解度呈先快速增加后缓慢增大的趋势，与黄艳燕等[20]报道水解大米蛋白的酶解时间与水解度的变化趋势相似。这可能是因为随着产物浓度的增加一定程度上抑制了反应的进行。考虑到经济及生产效率，最终选择水解时间为6 h用于后续工艺优化。

通过上述5个酶解水解度单因素试验发现：水解温度、水解时间及pH值对血球蛋白粉水解度具有显著影响(P<0.05)，蛋白酶与底物比和底物添加量对血球蛋白粉水解度的影响不显著(P>0.05)。

图3 水解温度对水解度的影响

图4 酶与底物比对蛋白水解度的影响

图5 水解时间对蛋白水解度的影响

由此，在响应面优化中仅对水解度具有显著影响的3个因素进行酶解工艺优化。其中固定酶与底物比(m酶∶m底物)为1∶250，底物添加量为8%。

2.4 响应面试验

2.4.1 响应面优化试验与回归模型分析 用Design-Expert 8.0.5软件对酶解工艺进行三因素三水平响应面优化设计，试验因素与水平见表3，结果见表4。

对试验结果进行二次多元回归模型拟合，分析得到血球蛋白粉酶解工艺的回归方程为：

Y=-616.485 25+56.702 5A+12.512B+12.561C-0.069 5AB+0.308 75AC-0.106 75BC-2.590 75A2-0.112 63B2-0.741 44C2。

(2)

为验证上述拟合模型的准确性和有效性，对回归方程进行方差分析，结果见表5。

表3 响应面试验因素与水平

表4 猪血球蛋白制备螯合肽的酶解工艺响应面分析结果

模型P<0.000 1差异水平极显著，失拟项不显著。由此可知，该模型可合理解释大部分试验变化情况。因此，该模型具有较好的合理性和准确性。

通过上述一次项回归方程，发现影响水解度的顺序为A>C>B，且A和C项影响呈极显著(P<0.000 1)；平方项中A2、B2和C2项均呈极显著(P<0.000 1)；交互项中只有BC项影响显著。因此，影响水解度大小因素顺序：pH值>水解时间>水解温度。

2.4.2 响应面图分析 由图6可知，当水解温度为50 ℃，pH值在9.0～10.0范围内增加时，蛋白水解度快速上升，pH值在10.0～11.0范围内增加时，水解度缓慢下降；pH值为10时，水解度随水解温度的增加先升后降。

表5 响应面回归模型的方差分析†

由图7可知，当水解时间为6 h，水解温度在45～50 ℃ 范围内增加时，蛋白水解度呈上升趋势，水解温度在50～55 ℃范围内增加时，水解度有下降趋势；水解温度为50 ℃时，水解度随水解时间的增加先升后降。

由图8可知，当水解时间为6 h，pH值在9.0～10.0范围内增加时，蛋白水解度快速上升，pH值在10.0～11.0 范围内增加时，水解度缓慢下降；当pH值为10时，水解度随水解时间的增加先上升后下降。

2.4.3 响应面试验最优工艺参数 由软件程序优化得到最佳工艺参数为pH值10.69、水解温度48.50 ℃、水解时间6.76 h。在此工艺条件下，猪血球蛋白粉的酶解水解度的预测值为37.81%。

按最佳酶解工艺设计3次平行实验，取试验数据结果的平均值，获得实测酶解水解度为37.83%，较预测值高0.02%。相对误差绝对值的平均值小于10%，表明响应面法优化的酶解工艺结果是准确可靠的。

图6 pH与水解温度相互作用影响的三维图和等高线图

图7 水解温度与水解时间相互作用影响的三维图和等高线图

图8 pH与水解时间相互作用影响的三维图和等高线图

2.5 猪血球蛋白肽金属螯合能力

将制备的酶解产物分别与FeCl2、ZnCl2和CuSO4溶液进行螯合，得到含有不同金属元素的螯合物，采用ICP-AES检测铁、铜和锌的含量，扣除空白，计算其金属螯合能力的强弱。以GSH和EDTA制备的金属螯合物为阳性对照[13,21]，进行螯合产物的活性比对。由表6可知，猪血球蛋白肽金属螯合物的铁、铜、锌螯合能力分别达到EDTA的38.45%，12.13%，50.78%，分别达到GSH螯合能力的46.55%，14.12%，62.23%。

3 结论

采用碱性蛋白酶水解猪血血球液中的血球蛋白制备水解物，并评价其金属螯合潜力。在单因素试验中发现，水解温度、水解时间和pH对蛋白水解具有明显影响，底物添加量和酶与底物比影响不显著。选择底物添加量为8%、酶与底物比(m酶∶m底物)为1∶250为固定条件，通过响应面试验优化血球蛋白酶解工艺，得到最佳工艺条件为pH 10.69，水解温度48.50 ℃，水解时间6.76 h。在该条件下，蛋白水解度的预测值为37.81%，实测值为37.83%。猪血球蛋白肽具有对铁、铜和锌离子的螯合能力，具有制备第4代微量元素补充剂的潜力。在后续试验中还需对金属螯合物的结构性质进行表征研究。

表6 猪血球蛋白肽金属螯合物的铁、铜、锌含量†