芪柏愈疡油对糖尿病大鼠溃疡创面中CD31表达的影响

杨旭，王丛

(江苏省南通市中医院，江苏 南通)

0 引言

糖尿病足溃疡(diabetic foot ulcer，DFU)是周围血管、神经病变及感染等因素综合作用的结果，常易导致皮肤溃疡，并出现不同程度的修复缺陷，为下肢截肢及死亡最常见的独立危险因素[1,2]，全球发病率为6.3%，中国发病率为4.1%[3]，其病情易反复发作，迁延不愈，其治疗是临床急需解决的重要难题之一。芪柏愈疡油是治疗糖尿病足溃疡的外用药，应用此药在临床上对糖尿病足溃疡患者进行治疗，总有效率达到88.2%，临床治疗中发现芪柏愈疡油可以减轻创面炎症反应，改善肉芽组织形态，促进血管生成。

血管生成主要包括内皮细胞的活化、迁移和增生以及周细胞募集、包裹促进血管成熟等几个阶段。为评估治疗过程中溃疡创面血管生成情况，我们采用血管内皮细胞特异性标志物血小板-内皮细胞粘附分子(Platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1/CD31)来检测创面新生微血管情况。此次研究以芪柏愈疡油为干预药物，以糖尿病大鼠溃疡模型为研究对象，采用Western Blot检测方法，研究芪柏愈疡油促进糖尿病大鼠溃疡创面愈合的作用，进一步明确芪柏愈疡油对溃疡创面的作用机制，为糖尿病足溃疡的中医外治疗法提供理论依据和数据支持，为更好发掘有效药物群、研发中药新药提供了前期的基础科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物与实验环境

SD雄性大鼠，8-10周龄，体重为150±20g，动物饲养及无菌手术均在动物实验室进行，实验动物饲养条件符合《实验动物普通环境及设施(编号为GB14925-200 1)》，饲养温度为21±2℃，相对湿度40-70%，室内明暗交替各12小时。SD大鼠分笼喂养，饲料与垫料均经消毒处理，垫料每日更换一次，保持垫料干燥。饮用水经煮沸后冷却至室温提供给动物。

1.1.2 实验药品

芪柏愈疡油：中药饮片由黑龙江中医药大学附属第一医院药剂科提供，黄芪、黄柏、大黄、白芷、赤芍、血竭等药物按比例配伍，制成浓度为每1mL含生药0.85g的黄色澄清液体，密封保存。

复方紫草油：由紫草、冰片、忍冬藤、白芷组成，辅料为麻油。性状为紫红色澄清液体，规格为30mL/瓶。武汉健民集团叶开泰国药(随州)有限公司，国药准字Z20044385，产品批号171242。

1.2 实验方法

1.2.1 糖尿病大鼠溃疡模型的建立

(1)糖尿病大鼠模型的建立

雄性SD大鼠80只，随机分为空白对照组(NC组)16只，糖尿病组(DM组)64只。所有大鼠适应性喂养1周后，于第2周注射STZ溶液，注射前所有SD大鼠需要禁食不禁水12h，造模当日称取所有大鼠体重，尾静脉采血测定基础血糖。按照65mg/kg的剂量对DM组大鼠一次性腹腔注射配制好的STZ溶液，建立糖尿病大鼠模型；对NC组大鼠腹腔注射等容积的0.1 mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。各组大鼠于注射STZ溶液1小时后自由进食进水，之后每日给予大鼠充足饮水和摄食，保持垫料干燥。注射STZ溶液后3天、5天、7天分别检测大鼠尾静脉随机血糖，血糖值2次或2次以上≥16.7mmol/L，则判定糖尿病大鼠模型造模成功[4]。

(2)糖尿病大鼠溃疡模型的建立

成功建立糖尿病大鼠模型2周后制作糖尿病大鼠溃疡模型，造模前12小时所有大鼠禁食不禁水，造模前3小时禁水，按0.3mL/100g的剂量对所有大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液进行麻醉。将麻醉后的大鼠俯卧位放在固定板上，固定住四肢，剪毛备皮，背部正中偏左侧做直径为2.0cm ×2.0cm的圆形标记，无菌条件下用剪刀剪去标记处全层皮肤(深达肌肉)，止血后用生理盐水冲洗创面[5]。

1.2.2 分组

未注射STZ溶液的大鼠为空白对照组(NC组)，将造模成功的糖尿病大鼠随机分为模型组(MG组)，芪柏愈疡油组(TG1组)、复方紫草油组(TG2组)。

1.2.3 给药方法

(1)空白对照组(NC组)与模型组(MG组)给药方法：碘伏消毒后，局部清创，用生理盐水完全浸渍后覆盖创面，外用无菌敷贴缠绕包扎，每天换药一次。

(2)芪柏愈疡油组(TG1组)给药方法：碘伏消毒，局部清创后，用生理盐水润洗创面，将含有芪柏愈疡油药液的纱布湿敷于大鼠创面，外用无菌敷贴缠绕包扎，每天换药一次。

(3)复方紫草油组(TG2组)给药方法：碘伏消毒，局部清创后，用生理盐水润洗创面，将含有紫草油药液的纱布湿敷于大鼠创面，外用无菌敷贴缠绕包扎，每天换药一次。

1.2.4 取材

在用药后7、14天，将大鼠麻醉后，剪取大鼠创面组织(包括创面周围正常皮肤组织)，将组织置于无菌细胞冻存管中，于液氮中速冻后转移至-80°冰箱中保存，用于WB检测。

表1 不同时间点各组大鼠创面中CD31的蛋白表达水平(±s)

表1 不同时间点各组大鼠创面中CD31的蛋白表达水平(±s)

注：*与NC组相比，P＜0.05；#与MG组相比，P＜0.05。

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图1 不同时间点各组大鼠创面中CD31的蛋白表达水平比较

1.2.5 统计学方法

采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析，数据以均数±标准差(±s)表示，组间差异比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间方差齐采用LSD法，方差不齐采用Tamhane's T2(M)法，以P＜0.05为具有统计学意义。绘图采用Graphpad 7.0软件。

2 结果

2.1 Western Blot检测创面组织中CD31的表达情况

WB检测结果显示，用药后7天，模型组(MG组)大鼠创面组织中CD31表达明显低于空白对照组NC组 (P＜0.05)，芪柏愈疡油组(TG1组)与复方紫草油组(TG2组)中CD31表达水平较与MG组均明显增加(P＜0.05)，TG1组与TG2组的表达无明显差异；药物干预后14天，MG组大鼠创面组织中CD31的表达水平仍明显低于NC组 (P＜0.05)，芪柏愈疡油组(TG1组)与复方紫草油组(TG2组)中CD31的表达较MG组明显增加(P＜0.05)，TG1组和TG2组未见明显差异，见表1及图1。(附加说明：1.MG组与NC组比较有明显差异，说明糖尿病大鼠创面与正常大鼠创面相比，确实存在血管生成异常、创面愈合延迟等慢性创面特征，模型成立；2.芪柏愈疡油组(TG1组)与MG组比较差异显著，说明存在治疗效果；3.复方紫草油是芪柏愈疡油的正效对照药，因为复方紫草油是公认治疗糖尿病创面愈合有效药物，TG1组与TG2组相比较无显著差异，说明芪柏愈疡油与复方紫草油作用相仿，疗效确切。)

3 讨论

CD31是在内皮细胞上介导细胞间黏附的整合素蛋白[6]，同时也是一种新型的微血管标记物，能够特异性标记新生血管内皮细胞，并参与血管生成过程[7,8]。但CD31在血小板、单核细胞、B淋巴细胞等细胞中少量表达。研究小鼠模型发现，CD31与细胞粘附功能有关，其胞内域的磷酸化作用能够调控细胞连接和细胞迁移，将CD31某些胞内域的表达敲除后，则会切断小鼠成纤维细胞间的信息连接[9]。CD31含有SHP-2停泊的特异位点，CD31胞内域的酪氨酸残基磷酸化，与SHP-2结合，可启动MAPK/ERK等信号通路，通过调控细胞的增殖、分化、迁移和凋亡等一系列活动，促进血管生成。

本次研究结果显示药物干预后7、14天，与模型组(MG组)相比，芪柏愈疡油组(TG1组)与复方紫草油组(TG2组)大鼠创面组织中CD31的表达均明显增加，且TG1组和TG2组作用未见明显差异，复方紫草油是目前临床上公认治疗糖尿病创面愈合的有效药物，能够有效促进创面血管新生，从而达到促进创面愈合的效果。此次研究中芪柏愈疡油对创面组织中CD31的表达影响与复方紫草油无明显差异，说明芪柏愈疡油能够通过提高大鼠创面组织中CD31的表达水平，有效促进创面血管新生，达到促进创面愈合的作用。