不同日龄王锦蛇小肠大小、组织学参数和酶活性的变化

姚利，刘溯源，伍亮，徐文宁，吴文欣，吴海燕，王鑫，高乐文，张志强*

(1. 安徽农业大学动物科技学院，安徽 合肥 230036；2. 安徽农业大学信息与计算机学院，安徽 合肥 230036)

表型可塑性(phenotypic plasticity)是指在环境影响下，某一基因型在表型上产生变异的能力。食物可诱导成体爬行动物的消化系统在器官大小、组织学和生理学层次表现出可塑性[1-3]。幼蛇的早期生活史阶段，如出壳、蜕皮和开口摄食的早晚及成功率，不但能影响其后续的生活史进程，也是蛇类养殖需要解决的主要难题之一[4]，但关于蛇类组织器官发育可塑性(developmental plasticity)的研究较少[5-9]。幼蛇的免疫功能随日龄增加而逐渐完善[5-6]，且受食物蛋白浓度的影响[7]；30日龄内虎斑颈槽蛇(Rhabdophistigrinus)的小肠组织学参数[8]及50日龄内滑鼠蛇(Ptyasmucocus)消化道5-羟色胺细胞的形态和分布密度[9]，均在开口摄食前后变化较大。目前，与体重、体长和体全长等整体反映蛇体健康状态和营养水平的指标相比[10-12]，对不同生活史阶段蛇类小肠大小、组织学参数和消化酶活性的变化仍缺乏研究。

王锦蛇(Elaphecarinata)属于游蛇科(Colubridae)锦蛇属动物，是一种适于人工养殖的无毒蛇，幼蛇喜食蛋白含量高的人工配合饲料，但难以消化淀粉类物质[7,13]。本研究选取出壳后3、7～10、20、30、40和50日龄的王锦蛇幼蛇，测定其身体及小肠长度和重量、组织学参数和消化酶活性的变化，以阐明小肠形态和功能建立，及其与特定生活史阶段的关系，为王锦蛇幼蛇开口饵料研发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

于2018年8月上旬从池州市龙井山蛇类驯养专业合作社购买10窝王锦蛇蛇蛋，每窝10个。在安徽农业大学动物生理生态学实验室内孵化蛇蛋，空调控制室温为(28 ± 2) ℃。将同一窝蛇蛋置于同一个长×宽×高=25 cm×12 cm×20 cm的塑料盒中，盒底铺手握不松散的湿沙，盒上方覆盖不滴水的湿纱布，孵化湿度为80%左右。将不同窝同一日龄出壳的幼蛇，置于同一爬宠饲养盒(长×宽×高=28 cm×18 cm×15 cm)内饲养，水自取，首次蜕皮后开始喂食乳鼠或脱毛雏鸡，每隔3～5 d投喂1次。取出壳后3、7～10 (首次蜕皮)、20、30、40和50日龄的王锦蛇，至同一日龄组达到8条幼蛇为止。

1.2 主要试剂和用品

苏木精、伊红、蛋白酶活性测定试剂由合肥博美生物科技有限责任公司提供；苦味酸、甲醛由合肥志宏生物技术有限公司提供；95%乙醇、无水乙醇、二甲苯由合肥中皖化学试剂有限公司提供；考马斯亮蓝法(A045-2)、麦芽糖酶(A082-3)和海藻糖酶(A149)活性测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所有限公司。生物组织用分析纯固体石蜡(熔点：58～60 ℃)、载玻片、盖玻片、中性树胶、直尺、塑料盒、爬宠饲养盒等均为市售产品。

1.3 动物解剖和组织学参数测定

测定王锦蛇幼蛇的体重和体全长后，断头处死，解剖取出消化道，测量小肠长度和湿重后，截取小肠前段、中段和后段各约1 cm，投入不含冰醋酸的Bouin氏液固定18～24 h后，常规梯度乙醇脱水、二甲苯透明，石蜡包埋，切片厚5 μm。采用改良的Harris苏木精染液[14]显示小肠前段、中段和后段各部位的组织学参数。剩余小肠组织称重后，-20 ℃冷冻保存，用于测消化酶活性。重长比(g/cm)=体重(g)/体全长(cm)；小肠湿重指数(%)=小肠湿重(g) × 100/体重(g)；小肠长度指数(%)=小肠长度(cm) × 100/体全长(cm)。

使用数码显微镜观察，拍照。利用Motic Images Plus 2.0软件测量小肠前段、中段和后段组织学参数[15]，即横截面直径(40×，图1A)、肌层厚度(100×，图1B)、绒毛高度(从圆形平滑肌层的内侧边缘至黏膜层的最外缘，100×，图1B)及肠道柱状上皮细胞短径与长径(位于绒毛顶端的肠道柱状上皮细胞，400×，图1C)。每条幼蛇小肠前段、中段和后段各随机选取1张切片，每张切片上的同一组织学参数计数3次，以其平均值表示该条幼蛇前段、中段或后段组织学参数的大小，以8条幼蛇的平均值表示该发育阶段小肠前段、中段或后段组织学参数的大小。

A. 小肠中段直径(D)；B. 小肠中段肌层厚度(ME)和绒毛高度(VH)；C. 小肠中段柱状上皮细胞短径(箭头所指，ED)和长径(EH)

1.4 消化酶活性测定

1.4.1 组织匀浆

取小肠组织0.2～1 g，在冰冷的生理盐水中漂洗剪碎，放入玻璃匀浆管中，用可调高速匀浆机在10 000～15 000 r/min条件下研磨成20%组织匀浆液，2 000 r/min离心15 min，取上清液备用。

1.4.2 消化酶活性测定

小肠组织蛋白含量用考马斯亮蓝法按试剂说明书测定；之后，按照麦芽糖酶、海藻糖酶活性测定试剂盒说明书，用722型分光光度计，分别在505 nm和550 nm处比色，测定吸光值。一定条件下(37 ℃、pH=6.0)麦芽糖酶活性大小定义为：1 mg蛋白组织每分钟水解1 nmol麦芽糖为一个酶活性单位(IU/mg prot)；海藻糖酶活性大小按照蛋白浓度计算，1 mg底物每分钟水解1 nmol海藻糖为一个酶活性单位(IU/mg prot)。

采用福林酚法测定蛋白酶活性，水浴温度为35 ℃[16]。通过标准酪氨酸溶液(100 μg/mL)设置6个浓度梯度，与Na2CO3溶液和福林酚试剂混合后，在680 nm下比色测定吸光值，绘制标准曲线。之后，采用福林酚试剂法测样品的蛋白酶活性，以10%三氯乙酸中止反应，680 nm下比色测定吸光值。蛋白酶活性的定义为：35 ℃、pH 7.5条件下，1 min水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸的酶量为一个酶活性单位(IU/g prot)。

1.5 数据统计分析

用SPSS 19.0 for windows进行数据处理。用单因素方差分析(One-way ANOVA)及多重比较(Multiple comparisons) Post hoc test统计出壳后3、7～10、20、30、40和50日龄组王锦蛇体重、体全长、重长比、小肠湿重指数、小肠长度指数、组织学参数(直径、肌层厚度、绒毛高度、肠道柱状上皮细胞短径和长径)和消化酶(麦芽糖酶、海藻糖酶和蛋白酶)活性的组间差异。文中数据均以平均值±标准误表示，P<0.05为差异显著。

2 结果

2.1 王锦蛇体重、体长、重长比和小肠大小的变化

王锦蛇体重各组间无显著差异(F5，42=2.029，P>0.05，图2A)，体全长50日龄组显著长于3日龄组(F5，42=3.330，P<0.05，图2B)，其他日龄各组之间都无显著差异；重长比3日龄组显著高于20、30和40日龄组(F5，42=4.191，P<0.05，图2C)，7～10和50日龄组与任一日龄组均无显著差异；小肠长度指数30日龄组与20、40和50日龄组接近，但显著高于3日龄组和7～10日龄组(F5，42=10.559，P<0.05，图2D)；小肠湿重指数50日龄组最高，且显著高于其他日龄组，3日龄组小肠湿重指数最低(F5，42=8.305，P<0.05，图2E)。

注：柱形图上标注的小写字母不同，表示日龄间的差异显著(P<0.05)，小写字母相同表示日龄间差异不显著(P>0.05)。下同

2.2 王锦蛇小肠组织学参数的变化

小肠前段直径3日龄组最高，7～10日龄组其次，3日龄组显著高于20和40日龄组(F5，42=5.048，P<0.05)，中段(F5，42=0.639，P>0.05)和后段(F5，42=1.602，P>0.05)无日龄差异。小肠前段肌层厚度3和50日龄组都显著高于20日龄组(F5，42=3.907，P<0.05)，中段50日龄组显著高于30日龄组(F5，42=2.704，P<0.05)，后段(F5，42=1.225，P>0.05)无日龄差异。小肠前段绒毛高度3日龄组最高，50日龄组其次，3日龄组显著高于除50日龄组外的其他日龄组(F5，42=7.395，P<0.05)，中段无日龄差异(F5，42=0.858，P>0.05)，后段50、30和20日龄组都显著高于40日龄组(F5，42=3.941，P<0.05)。小肠前段柱状上皮细胞短径3和30日龄组显著高于7～10日龄组(F5，42=3.769，P<0.05)，中段3日龄组显著高于20和40日龄组(F5，42=2.517，P<0.05)，后段(F5，42=1.712，P>0.05)无日龄差异。小肠前段柱状上皮细胞长径50日龄组显著高于7～10日龄组(F5，42=3.881，P<0.05)，中段(F5，42=2.258，P>0.05)和后段(F5，42=1.489，P>0.05)无日龄差异(表1)。

表1 王锦蛇小肠前段、中段和后段组织学参数的增龄变化

麦芽糖酶活性呈波浪形波动，但日龄组间的差异不显著(F5,42=2.218，P>0.05，图3A)；海藻糖酶活性3日龄和7～10日龄组都显著高于50日龄组(F5,42=5.204，P<0.05，图3B)，其他日龄组间的差异不显著；蛋白酶活性40日龄组显著高于3日龄组(F5,42=4.334，P<0.05，图3C)，其他日龄组间的差异不显著。

图3 王锦蛇小肠麦芽糖酶(A)、海藻糖酶(B)和蛋白酶活性(C)的变化

3 讨论

在蛇类生长发育的早期阶段，与体重、体全长等相比，重长比这一指标能更全面地反映蛇体的健康状态，具有可塑性[5-7, 17]。与灌喂8%、12%和24%蛋白含量的食物组相比，16%和20%蛋白含量食物组的王锦蛇的重长比增幅最快[7]。50日龄内，滑鼠蛇的重长比3～20日龄阶段增长缓慢，之后快速增加，至50日龄达到最高值[6]。然而，与滑鼠蛇不同，本研究发现王锦蛇的重长比以3日龄时为最高，20～40日龄下降，至50日龄后又回升，这可能与其初生重重于滑鼠蛇有关[6]。王锦蛇出壳后体内含有来源于胚胎时期的大量脂肪，可供首次蜕皮前的幼蛇消耗使用，且随日龄增加而逐渐减少。与出壳后3 d相比，王锦蛇在首次蜕皮和开口摄食前后，其体重均有小幅度下降，但体全长逐渐变长，故重长比趋于降低。本研究以乳鼠刺激王锦蛇开口摄食，开口后喂食脱毛雏鸡，乳鼠和雏鸡都是王锦蛇喜好的食物，幼蛇从食物中获得营养物质后，其生长发育速度加快，所以重长比趋于增加。

成体两栖爬行动物小肠大小和组织学参数的可塑性与季节[18]、饥饿胁迫[19]等因素有关，小肠重量可能先于长度改变[3]，消化酶活性随季节而波动，但不受食物成分影响[20]。王锦蛇出壳后小肠大小、组织学参数和消化酶活性都发生了适应性改变，可能与其食性及早期复杂的生活史有关。野外条件下，王锦蛇食性广泛，可捕食鼠、鸟、鸟蛋及其他小型动物[4]，本研究以乳鼠和脱毛雏鸡作为王锦蛇的食物来源，能满足其生长发育需要[7]。50日龄内，王锦蛇经历了出壳、首次蜕皮和开口摄食等多个关键生活史阶段，小肠长度和湿重指数分别在30和50日龄组最高，长度先于湿重发生改变，与成体对饥饿的反应相反[19]，这可能与在食物资源充足情况下，幼蛇囫囵吞食且贪食，开口后摄食频率较高，需要更大的空间及更长的时间来处理和消化食物有关。小肠是执行消化吸收功能的主要场所，从前段至后段消化吸收能力逐渐减弱[4]。本研究发现王锦蛇小肠前段的直径、肌层厚度、绒毛高度、肠道细胞短径和长径等参数都在3和/或50日龄组最高，7～10、20或30日龄组最低，呈现出先降后升的变化趋势，说明40～50日龄小肠的形态发育仍未趋于稳定，晚于虎斑颈槽蛇的30日龄[8]。王锦蛇小肠中段柱状上皮细胞的短径3日龄组显著高于20和40日龄组，肌层厚度50日龄组显著高于30日龄组，但柱状上皮细胞的长径无明显变化，小肠后段的绒毛高度在40日龄组显著下降，这可能与其消化生理状态有关，紧缩的短径和萎缩的绒毛有助于蛇体节约能量[2,19]。与小肠前段组织学参数的变化不同，王锦蛇小肠麦芽糖酶活性无明显的日龄差异，这与其对淀粉类物质消化能力较差有关[11,13]。然而，海藻糖酶活性3日龄组和7～10日龄组均显著高于50日龄组，说明王锦蛇出壳后和开口摄食前的体内脂肪经代谢后可转化为糖原，而海藻糖酶是广泛存在于小肠上皮细胞膜刷状缘的一种胞外酶，能催化水解一分子海藻糖生成两分子葡萄糖[20]，王锦蛇早期生活史阶段小肠海藻糖酶含量较高，这有利于其存活。海藻糖酶活性在王锦蛇主动摄食后趋于下降，并在50日龄组达到最低值，而蛋白酶活性40日龄组显著高于3日龄组，说明开口摄食后以水解糖类为主的酶类钝化，蛋白水解酶活性增强，这与小肠消化和吸收功能的建立相匹配，建议可在40～50日龄期间提高王锦蛇食物中的蛋白含量、加大投喂频率。

4 结论

本研究首次从小肠大小、组织学参数和消化酶活性整合变化的角度证实了蛇类小肠的发育可塑性，提示王锦蛇的消化吸收功能虽已建立，但小肠发育尚需完善，建议40日龄后可谨慎投喂体积较大、低淀粉高蛋白含量的食物。