胃癌组织中LncRNA SNHG3的表达及意义

谷建斌 张国欣 张玉斌 薛菲 王冬冬 耿蕴峰

胃癌是严重威胁人类健康的全球性疾病之一[1]，而我国每年胃癌新发病例占世界新发病例>40%，死亡率居于第2位[2]。胃癌的病因涉及遗传因素、表观遗传因素、环境因素等多种因素及环节，具体机制尚未完全阐明。早期胃癌的治疗效果较好，在进展期胃癌的治疗中，手术、放疗、化疗是治疗的主要方法，但是易于局部淋巴结、肝脏、腹腔转移，预后较差，5 年生存率低于30%[3,4]。因此，人们在不断寻找能够作为胃癌诊断的生物学标志物和相关的治疗靶点。长链非编码RNA (long non-coding RNA,IncRNA)指长度>200个核苷酸的非编码RNA，近年来的研究结果发现，在多种肿瘤组织和正常组织中存在差异表达的lncRNA[5,6]，在多种肿瘤如胃癌、结肠癌、肝癌、乳腺癌、脑胶质瘤的发生、发展、转移以及复发过程中的重要作用也得到了证实[7-11]。高通量转录本测序显示，在胃癌中，与癌旁组织比较，在胃腺癌组织中存在表达差异达2倍以上的74条lncRNA，其中上调的有43条，下调的有31条，提示在胃癌生物学过程中，lncRNA发挥了重要作用[12]。在发现的74条差异表达的lncRNA中，经检索文献，发现核仁小分子RNA宿主基因3(SNHG3)在肝癌、结直肠癌中异常高表达，与肿瘤的发生、发展、转移密切相关[13,14]。lncRNA SNHG3位于1p35.3，在肝细胞肝癌中表达水平显著增高，与肿瘤大小、门静脉瘤栓、复发显著相关， SNHG3可以作为肝细胞肝癌不良预后的指标[13]。在结直肠癌中，SNHG3表达显著上调，功能获得和功能缺失试验显示SNHG3能够促进结直肠癌细胞的增殖，进一步研究发现SNHG3是通过作为内源性竞争性RNA(ceRNA)与miR-182-5p相互竞争，导致c-Myc表达升高并作用于c-Myc的目的基因，从而促进了结直肠癌进展，可以得到SNHG3异常高表达是结直肠癌患者不良预后的指标[14]。在胃癌中，lncRNA SNHG5的表达中显著降低，其可抑制胃癌细胞的增殖和转移，可以作为胃癌治疗的药物作用靶点[15]。而在胃癌组织中lncRNA SNHG3的表达及临床意义的报道少见，因此，本研究将lncRNA SNHG3作为研究对象，对其在胃癌组织中的表达情况进行检测，并结合临床资料进行分析，为进一步探讨其作用奠定基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2016年2～7月手术切除的42例胃癌标本及5 cm处胃黏膜组织标本，病例均经病理诊断证实为胃腺癌，除外合并其他恶性肿瘤，以及术前接受放疗、化疗和其他针对胃癌治疗的患者。其中男32例，女10例;年龄26～77岁，平均年龄(59.8±11.3)岁；伴淋巴结转移者33例；TNM分期Ⅰ期2例，Ⅱ期10例，Ⅲ期27例，Ⅳ期3例。该实验所用标本通过医院伦理委员会讨论通过，并征得患者知情同意。

1.2 主要试剂与仪器 lncRNA SNHG3、β-Actin引物使用primer primer 5软件设计，由上海生工公司合成。TRIzol试剂,美国Invitrogen公司;M-MLV反转录试剂盒，美国promega公司；焦碳酸二乙醋(DEPC),美国sigma公司;SYBR Green PCR Master Mix试剂盒，全式金公司； Roter gene 3000，澳大利亚Corbett公司；NanoDrop ND-2000分光光度计，美国NanoDrop公司。

1.3 LncRNA SNHG3的表达检测 采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法对胃癌组织及癌旁(距离癌组织>5 cm)正常胃黏膜组织中lncRNA SNHG3表达进行检测。收集术中新鲜获取的癌组织及癌旁组织，冻存管内液氮速冻，转运至实验室后置于-80℃冰箱保存。分别取约100 mg组织，将组织冰上研磨后加入2 ml的TRIzol试剂，应用TRIzol 法提取组织中总RNA，以总RNA为模板，用反转录试剂盒进行反转录，合成cDNA，分光光度计鉴定cDNA 纯度，使A260/A280=1.8～2.2，-20℃冰箱保存待测。实验步骤严格按照反转录试剂盒说明书进行。2×SYBR Green PCR Master Mix 试剂盒检测lncRNA SNHG3的表达。lncRNA SNHG3上游:5’AGACAGATTCGCAGTGGTCG3’下游:5’GTCTCCATGGCCCACTTCTG3’。β-Actin 上游引物 5’- CACCCCAGCCATGTACGTTG-3’，下游引物 5’- AATGTCACGCACGATTTCCC-3’。荧光定量PCR 反应体系:2 ×SYBR Green PCR Master Mix 10 μl，上下游引物各0.5 μl，模板2 μl，加RNAase-free 的双蒸水7 μl。反应条件:95℃预变性 30 s，95℃ 变性10 s，60℃退火 10 s，72℃延伸20 s共40个循 环。所有反应于Roter gene 3 000实时定量PCR 仪上完成，每个样本重复3 次。采用相对CT 值方法进行数据分析，计算组织中目的基因 lncRNA SNHG3 表达量，△CT=CTlncRNA-CTβ-Actin；△△CT=(CTlncRNA-CTβ-Actin)实验组-(CTlncRNA-CTβ-Actin)对照组；癌组织和癌旁组织的表达量统计时，各样本的相对表达量=2-△CT，2-△△CT表示癌组织lncRNA SNHG3表达量相对于癌旁组织的变化倍数。

2 结果

2.1 qRT- PCR的熔解曲线与扩增曲线 qRT- PCR结束后，测定熔解曲线，β-Actin及LncRNA SNHG3产物熔解曲线均为单一曲线，说明反应未出现非特异性扩增。qRT- PCR产物扩增曲线显示结果重复性好，实验精确度高。见图1、2。

图1 胃癌与癌旁组织中lncRNA SNHG3及β-Actin的熔解曲线

图2 胃癌与癌旁组织lncRNA SNHG3及β-Actin的扩增曲线

2.2 LncRNA SNHG3在胃癌组织和癌旁组织中的表达情况 胃癌组织中lncRNA SNHG3△CT值为4.87±1.38,癌旁组织中lncRNA SNHG3△CT值为5.66±1.22,差异有统计学意义(t=4.01,P=0.0002 )。胃癌组织、癌旁组织的lncRNA SNHG3相对表达量(2-△CT)分别是0.0358(0.0208～0.0860)、0.0215(0.0140～0.0330)，差异有统计学意义(Z=2.85,P=0.0043)。42对样本中，有30对(71.4%，30/42)的胃癌组织的lncRNA SNHG3表达量高于癌旁组织，其中20对(47.6%，20/42)的胃癌组织中lncRNA SNHG3表达量占癌旁组织≥2倍。见表1，图3、4。

表1 LncRNA SNHG3在胃癌组织和癌旁组织中的表达

图3 LncRNA SNHG3在胃癌组织和癌旁组织中的△CT

图4 LncRNA SNHG3在胃癌组织中的相对表达

2.3 LncRNA SNHG3与胃癌临床病理的关系 根据lncRNA SNHG3在42例胃腺癌组织中的相对表达量是否≥2倍，分为高表达组和低表达组。60.6%的胃癌T3+T4期患者lncRNA SNHG3为高表达，而在T1+T2期胃癌患者均为低表达，差异有统计学意义(χ2=8.1252，P=0.0044)。淋巴结转移组中有57.6%的患者lncRNA SNHG3高表达，在无淋巴结转移组有11.1%患者高表达，差异有统计学意义(χ2=4.399，P=0.039)。TNM分期Ⅲ+Ⅳ期患者63.3%的lncRNA SNHG3高表达，显著高于Ⅰ+Ⅱ期患者的8.3%(χ2=10.395，P=0.0013)。见表2。

2.4 LncRNA SNHG3表达水平与胃癌血管、神经侵犯的关系 LncRNA SNHG3的表达水平与患者年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤位置、分化程度无关,与血管侵犯、神经侵犯无关。见表3。

3 讨论

在人类基因组序列中,仅有1.5%的核酸序列用于蛋白质编码,而占据人类基因组98.5%的是非蛋白编码序列,非编码RNA 是一大类不具有蛋白编码潜能的RNA 转录本[16],不具有开放阅读框，无蛋白翻译功能。其几乎能参与整个生命周期基因调控的每一步：包括染色体剂量补偿，印迹，表观遗传调控，转录，mRNA 剪接和翻译[17]等。按照lncRNA分子功能的不同,研究人员将lncRNA分为4 种：(1)信号分子; (2)诱饵分子; (3)引导分子; (4)支架分子[18]。lncRNA可在转录及转录后水平调控蛋白的表达[19]。有的lncRNA可具有致癌作用，如HOX转录反义RNA(HOX transcriptantisense RNA,HOTAIR)，它是第1个被发现具有反式转录调控作用的lncRNA，作为分子支架发挥作用。HOTAIR在胃癌淋巴结转移、腹膜播散的患者高表达，提示预后不良[20]。有的lncRNA则具有抑癌作用，如在胰腺癌和乳腺癌中，MEG3可以抑制MDM2蛋白的表达从而活化p53通路达到抑癌作用[21,22]；有的lncRNA兼具有致癌及抑癌的双重作用[23,24]。因此对lncRNA进行深入研究，能够为肿瘤的诊断和治疗提供重要的科学依据。

表2 LncRNA SNHG3表达水平与胃癌临床病理资料关系 n=42，例(%)

表3 LncRNA SNHG3表达水平与胃癌血管、神经侵犯的关系 n=42，例(%)

核仁小分子RNA(snoRNAs)以及snoRNAs的失调在癌症的发生与发展过程中发挥重要作用，其宿主基因3 (SNHG3)是一种lncRNA，也称为核仁小分子RNA U17的宿主基因(U17HG)，位于1p35.3。基因内的U17核仁小分子RNA宿主基因最初由Pelczar P发现，这位学者将人类和老鼠的U17HG进行对比，发现在两个物种间核仁小分子RNA仅编码内含子，并且没有蛋白编码特性[25]。近期研究发现,在结直肠癌、肝内胆管细胞癌[26,27]中lncRNA SNHG3的表达显著增高，提示SNHG3有可能在肿瘤的发生、发展中起到了重要作用。

本实验中，应用qRT-PCR 方法，检测了42例胃癌组织样本和癌旁组织中的lncRNA SNHG3的表达情况，发现胃癌组织的lncRNA SNHG3相对表达量显著高于癌旁组织(Z=2.85,P=0.0043)，这与前期的高通量测序及qRT-PCR验证的结果提示lncRNA SNHG3在胃癌组织中高表达[10]，二者结果一致。42对样本中，有20对(47.6%，20/42)的胃癌组织中lncRNA SNHG3表达量是癌旁组织的2倍及以上。提示了SNHG3可能在胃癌的发生发展中发挥着类似癌基因的作用。张子龙等[28]利用癌症基因图集(TCGA)数据分析发现，SNHG3在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期胃癌组织中的表达均显著高于相应的癌旁组织，并且高表达lncRNA SNHG3的胃癌患者的生存时间显著低于低表达的胃癌患者。在其他的消化道肿瘤中也有类似结果。Wen等[26]发现在结直肠癌中，lncRNA SNHG3的表达较癌旁组织显著增高，而且在四株结肠癌细胞HCT116,LoVo,SW480,and SW620中的表达较正常结肠细胞株NCM460中的表达显著增高。Tian等[27]发现，在52例肝内胆管细胞癌中，lncRNA SNHG3的表达较癌旁组织显著增高，并且与TNM分期相关，lncRNA SNHG3可以作为肝内胆管细胞癌预后的独立危险因素。

将lncRNA SNHG3的表达水平与胃癌患者临床病理资料统计分析发现，60.6%的胃癌T3、T4期患者lncRNA SNHG3高表达，而在T1、T2期胃癌患者无1例lncRNA SNHG3高表达(χ2=8.1252，P=0.0044)。淋巴结转移组中有57.6%的患者lncRNA SNHG3高表达，在无淋巴结转移组有11.1%患者lncRNA SNHG3高表达，差异有统计学意义(χ2=4.399，P=0.039)。Xuan等[29]在60例胃癌样本的研究中也发现，淋巴结转移阳性的胃癌患者较阴性的患者lncRNA SNHG3，高表达lncRNA SNHG3的患者在总生存率和无转移生存率预后不佳。本研究中，TNM分期Ⅲ+Ⅳ期患者63.3%的lncRNA SNHG3高表达，显著高于Ⅰ+Ⅱ期患者的8.3%(χ2=10.395，P=0.0013)。近期研究也发现，SNHG3能够较好地指示胃癌的临床分期，在高分期胃癌中的表达水平呈现显著上升的趋势[28]，与我们的结果相一致。在大肠癌的研究中也发现，癌组织中SNHG3的表达显著增高，与临床分期、远处转移呈正相关，总体生存率低。功能实验表明下调SNHG3表达在体内外均能显著降低大肠癌的生长和转移，提示SNHG3可能作为潜在的治疗大肠癌的靶点[26]。本研究结果显示胃癌组织中lncRNA SNHG3的表达水平与肿瘤的浸润深度、淋巴结转移、TNM分期显著相关，提示lncRNA SNHG3在胃癌的发生、发展、侵袭、转移的过程中有可能起到了致癌基因样作用。

综上所述，胃癌组织中lncRNA SNHG3表达显著增高，表达水平与肿瘤的浸润深度、淋巴结转移、TNM分期显著相关。提示lncRNA SNHG3可能作为潜在的治疗胃癌的目标靶点。但lncRNA SNHG3调控胃癌进展、转移的具体机制需要以后进一步的细胞实验、动物实验去证实和明确。