NLRP3在血栓栓塞性疾病中的研究进展*

李树林，傅应云*

(暨南大学第二临床医学院，广东省深圳市人民医院呼吸疾病研究所，深圳 518020)

模式识别受体可分为两类，一类是膜结合受体，如Toll样受体；另一类是区分于膜结合受体的细胞内模式受体，如核苷酸结合寡聚化结构域(nucleotide binding oligomerization domain,NOD)样受体(NOD like receptors,NLRs)。NLRs一般包括3个结构：C端识别配体的亮氨酸富集区、中间区发挥低聚化作用的核苷酸结合寡聚化域、N端调节蛋白质相互作用的效应结构域[募集域(Caspase recruitment domain,CARD)、热蛋白结构域等]。NLRP3是NLRs中近年来研究最为广泛及热门的成员之一。NLRP3炎症小体由感受蛋白NLRP3、衍接蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD,AS-C)、效应蛋白半胱天冬酶-1(Caspase-1)组成[1]。NL-RP3通过病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)和损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns,DAMPs)被激活，激活后的NLRP3募集ASC，使pro-Caspase-1激活成Caspase-1，三者形成复合物，即NLRP3炎症小体，进而激活白细胞介素(interleukin,IL)-18、IL-1β 前体的激活和分泌，促进炎症的发展，参与疾病的发生[2]。NLRP3在2型糖尿病、老年痴呆症、慢性阻塞性肺疾病、支气管哮喘等疾病中发挥重要作用。血栓栓塞性疾病包括动脉栓塞及静脉栓塞，均与静脉内皮损伤、血小板密切相关。炎症小体NLRP3在动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)血栓形成中的作用近年也成为深入研究的一方面，但对静脉血栓形成的研究仍较少。现就NLRP3在两种疾病中的研究进展进行综述。

研究[3]表明，NLPR3炎症小体完整的激活需要经过两个阶段。第一阶段是启动阶段，PAMPs或DA-MPs被识别后，导致炎症小体的成分前体产生或激活，如Pro-IL-18、Pro-IL-1、NLRP3；第二阶段是激活阶段，即各组分(NLRP3蛋白、ASC、Caspase-1)的组装形成NLRP3炎症小体及IL因子的参与。目前NLRP3激活阶段的具体机制仍有争议，主要有3种模式：(1)低K+环境：某些物质刺激细胞后，在细胞膜表面形成小孔，大量的K+外流，细胞内形成低K+环境，从而活化NLRP3炎症小体；细胞外的ATP与细胞膜上的P2-X7受体结合后，由Pannexin-1也能在膜上形成小孔，造成低K+[4]；(2)溶酶体损伤：某些无机粒子或晶体可被巨噬细胞吞噬，吞噬后会导致巨噬细胞内溶酶体的损伤及数量减少，从而作为DAMPs，激活N-LRP3炎症小体[5]；(3)活性氧：活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS）通过作用硫氧还蛋白，使其裂解，形成硫氧还蛋白作用蛋白(thioredoxin interacting protein,TNXIP)，从而激活NLPR3炎症小体[6]。

1 血管内皮细胞与血栓

完整的血管内皮细胞把血液中的血小板、凝血因子和有高度促凝作用的内皮下细胞外基质分隔开，完整的内皮细胞具有屏障保护作用。血管内皮细胞的破损是动静脉血栓形成的第一步。内皮细胞破损会出现大量NLRP3炎症小体，而NLRP3炎症小体的产生又进一步引发内皮细胞的损伤。K.KINNUNEN等[7]通过溶酶体消融剂作用于人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)并观察NLRP3表达的水平，证实了通过溶酶体损伤机制激活了NLRP3，促进IL-6、IL-8的分泌，从而作用于HUVECs。H.YANG等[8]报道，原花青素B2抑制HUVECs中脂多糖诱导的NLRP3表达水平、Caspase-1活化及IL-1的分泌。J.SONG等[9]发现芒果苷可降低R-OS水平，通过抑制内质网相关TXNIP的激活，从而抑制NLRP3的激活及后续IL-1β 的活化及分泌，保护内皮细胞免受进一步损伤。除了某些外来物质的作用，血流动力学的改变也可通过NLRP3介导内皮细胞的损伤，但这多发生于动脉栓塞性疾病中，因为动脉血液流速快，在大动脉分叉处会形成异常的低剪切力，诱导血管内皮细胞表达NLRP3增高，IL-1β 分泌增多，加重AS等动脉血栓前病变[10]。

2 NLRP3与动脉血栓疾病

2.1 NLRP3与动脉粥样硬化 普遍认为，AS发病过程中，无菌炎症发挥着重要作用。G.P.VARGHESE等[11]通过对瑞典555例心肌梗死患者与1 016个健康人的DNA分析，明确了NLRP3基因下游调控区域的4个单核苷酸多态性位点(SNPs)，证实NLRP3炎症小体单基因多态性与AS密切相关。F.ZHENG等[12]对36例冠状动脉搭桥手术患者升主动脉组织与10名捐献肾脏正常人进行对比，得出冠状动脉粥样硬化患者动脉NLRP3炎症小体表达水平与冠状动脉粥样硬化的严重程度呈正相关的结论。

2.1.1 NLRP3与巨噬细胞关系最密切 巨噬细胞是IL-1β 最主要的来源，外来的因素或巨噬细胞内的某些物质通过激活IL-1β 而引起AS的发生。K.RAJAMÄKI等[13]首先指出，胆固醇结晶激活NLRP3炎症小体，促进IL-1β 的形成和分泌，参与AS的发生，具体机制：巨噬细胞识别并吞噬胞外的胆固醇晶体，超载的胆固醇结晶导致溶酶体破裂、溶酶体内的组织蛋白酶B渗入胞质、钾离子的外流形成的细胞内低钾环境，从而激活NLRP3炎症小体，pro-IL-1β形成IL-1β 分泌出细胞外，引发AS炎症反应。除了以上几种方式，胆固醇晶体激活NLRP3炎症小体仍存在其他的途径。E.O.SAMSTAD[14]指出胆固醇晶体激活补体旁路，引发细胞因子如肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)的释放，补体C5a与TNF的形成复合体作为引发物激活NLRP3炎症小体，激活IL-1β。磷酸钙也可通过溶酶体破裂、组织蛋白酶B渗漏的机制激活NLRP-3，参与AS炎症过程。除了胆固醇结晶，氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,oxLDL) 也是巨噬细胞中激活炎症反应的关键物质，oxLDL通过CD36介导的ROS途径，激活NLRP3炎症小体，激活Caspase-1，使巨噬细胞内IL-1β 分泌，促使泡沫细胞形成。使用IL-1β 抗体或IL-1RA后，泡沫细胞形成明显减少，间接证明IL-1β 在AS炎症反应发生过程中的作用[15]。除此之外，游离脂肪酸[16]、血清淀粉样蛋白A[17]、单钠尿酸盐[18]等均通过巨噬细胞激活NLRP3，促进IL-1β 参与AS的发生发展。

2.1.2 NLRP3促进AS与血管平滑肌细胞(smooth muscle cells,SMC)相关 中膜SMC迁移入内膜并增生，是AS进展期病变形成的主要环节。迁入内膜的平滑肌细胞摄取低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)或极低密度脂蛋白(very low-density lipoprotein,VLDL)后成为肌原性泡沫细胞，参与AS斑块的形成。SMC与动脉中膜钙化联系密切。外源性的磷酸钙通过NALP3引起血管钙化，赵曼等[19]通过建立大鼠主动脉钙化模型，注射siNALP3的试验组大鼠，血清IL-1β 水平明显下降，说明siNALP3抑制血管平滑肌的钙化，从而也说明炎症小体是血管钙化发生的基础。C.WEN等[20]发现，大鼠的主动脉血管SMC在β-磷酸甘油的作用下可发生钙化，细胞内的NLRP3炎症小体的mRNA表达明显升高，IL-1β 分泌增多；而当NLRP3蛋白被沉默后，SMC的钙化也受到抑制。T.N.TANGI等的研究[21]同样证实了在主动脉平滑肌中NLRP3的表达上升，IL-1β 的分泌促进AS的发生。

2.2 NLRP3与心肌梗死 在动脉粥样斑块形成的基础上，斑块内发生继发性改变，如斑块内出血、斑块破裂、钙化、血栓形成等，改变的斑块堵塞冠脉即导致心肌梗死。在心肌梗死发生发展中，无菌性炎症同样发挥关键作用，而IL-1β 是心肌梗死炎症反应早期的关键物质，提示着NLRP3炎症小体的重要作用。动物实验[15]证实，IL-1β 的中和抗体及阿那白滞素(某种重组IL-1受体拮抗剂)能减轻急性心梗的损伤。除此之外，NLRP3在心梗后缺血再灌注中同样有着极其关键的作用，主要通过心肌细胞、心肌成纤维细胞[22]。在小鼠心梗模型中，ASC表达水平上升主要在发生浸润的中性粒细胞和巨噬细胞中，还发生在心肌细胞和心肌成纤维细胞，与人类是一样的。M.TAKAHASHI[23]应用ASC-knockout(KO)和Caspase-1-KO小鼠建立左前降支闭塞缺血再灌注模型，发现炎症反应明显减低，包括炎细胞浸润减少，细胞因子、趋化因子等表达下降；同时发现小鼠心肌梗死面积、心肌纤维化程度、左室功能障碍均明显减轻。提示心肌细胞及成纤维细胞参与心梗缺血再灌注的机制与炎症过程相关。进一步发现，同样是ASC-KO的模型，非骨髓移植细胞心梗面积的减少程度与骨髓移植细胞相似，这也表明非骨髓来源的心肌细胞、心肌成纤维细胞在心梗缺血再灌注炎症反应中的作用。但在心肌细胞和心肌成纤维细胞中NLRP3引发缺血再灌注损伤的具体机制近年研究颇多，观点稍有不同。S.MARIATHASAN等[24]发现，P2X7是一种嘌呤受体通道，它会被损伤细胞释放出细胞外的ATP激活，引发钾离子流出，进而激活NLRP3，最终引起Caspase-1依赖的心肌细胞死亡，即细胞焦亡。而Ø.SANDANGER团队[25]在小鼠心梗模型中，NLRP3在心肌成纤维细胞中表达显著上调，组织损伤后释放的ATP刺激心肌成纤维细胞分泌IL-1β。前者强调的是NLRP3心肌细胞细胞焦亡途径，后者强调的是NLRP3引发心肌成纤维细胞分泌IL-1β。综上，心肌细胞与心肌成纤维细胞在心梗缺血再灌注的炎症反应中发挥着不同但重要的作用，都通过NLRP3炎症小体最终引起心肌炎症及心肌重构。

2.3 NLRP3与脑血管疾病 对于NLRP3与脑血管疾病的研究，主要集中在NLRP3介导缺血性脑卒中的损伤及炎症反应机制。D.Y.FANN等[26]研究发现，在缺氧缺糖的条件下，NLRP3蛋白、IL-1β、IL-18在皮层神经元中水平均上升，同时在大脑缺血再灌注小鼠模型及脑卒中死亡患者脑组织中，NLRP3水平也明显升高。但F.YANG等[27]在小鼠大脑中动脉阻塞的模型中发现NLRP3在小胶质细胞和内皮细胞中的表达为主，提示小胶质细胞、内皮细胞可能才是脑卒中机制的研究靶点。但无论是神经元还是小胶质细胞、内皮细胞，均提示NLRP3炎症小体是缺血性脑血管病中炎症反应的重要角色。F.YANG等[27]还发现，在大脑中动脉闭塞小鼠模型中，NLRP3-/-小鼠脑组织的坏死范围、水肿程度、血脑屏障的通透性均比普通小鼠减轻，表明NLRP3还与缺血后血脑屏障的损伤相关[27]。NLRP3介导的脑缺血后炎症反应有多种机制，主要有ROS途径和核因子/丝裂原激活的蛋白激酶(nuclear factor-κB/mitogen-activated protein kinase,NF-κB/MAPK)通路。如前所述，ROS途径同样存在于脑缺血再灌注损伤NLRP3的调控，通过TNXIP激活NLRP3，引发下游的改变进行调控。而NF-κB/MAPK通路是更新的观点。NF-κB/MAPK信号通路的激活使NLRP3的表达水平上升，而体外或体内的脑缺血条件下，这两种信号通路的药物抑制剂会使这种激活NLRP3的作用明显减弱；静注免疫球蛋白就是通过抑制NF-κB/MAPK信号通路，从而抑制NLRP3的表达而达到减轻脑卒中缺血再灌注损伤的作用[26]。综上，NLRP3介导的炎症反应在脑卒中缺血后损伤及血脑屏障损伤中作用显著。

3 NLRP3与静脉血栓形成

血小板与NLRP3炎症小体是研究热点，在内皮细胞受损后，血小板聚集、黏附于内皮破损处，进而血小板活化，分泌活性物质进一步引发周围血小板黏附及活化。P.MURTHY等[28]指出，血小板中NLRP3炎症小体促进血小板的激活、聚集和体外血栓形成；在已激活的血小板中，NLPR3炎症小体表达上调；血小板中的bruton′s酪氨酸蛋白激酶在调控NLRP3的对血小板作用中起着关键的角色。NLPR3炎症小体的激活，促进IL-1β 的成熟与分泌，在体内氯化铁(FeCl3)栓塞模型中，在白细胞导致各种机能障碍前，IL-1β 已在血小板富集处被大量检测到，说明IL-1β 在栓塞早期发挥着重要作用，也提示了NLRP3的作用。IL-1β 作为一种新的血小板兴奋因素，促进血小板的激活，同时激活的血小板会再次引起IL-1β 的激活，从而使更多的血小板活化，引起血栓形成，所以IL-1β 作为血小板激活剂将血栓形成与免疫反应联系起来。E.D.HOTTZ等[29]发现登革热感染后，通过依赖ROS的途径激活NLRP3炎症小体，促使血小板原性的IL-1β 从微粒中释放，进而导致内皮细胞渗透性的增高，引发登革热的一系列临床表现。提示了炎症小体NLRP3与血小板的关系，但涉及NLRP3通过血小板引起静脉血栓栓塞的报道仍较少。同样为NLRs家族的核苷酸结合寡聚化结构域(nucleotide binding oligonucleotide structure domain 2,NOD2)，S.ZHANG等[30]首次提出血小板中NOD2的表达及其功能在血小板的激活和血栓形成中的作用，为血小板激活机制的研究提供了新的观点，同时也强调了血小板NOD2在血栓形成与免疫及炎症之间的关键的桥梁作用。N.GUPTA等[31]研究了高海拔肺栓塞患者NLRP3炎症小体促进由低氧导致静脉血栓栓塞的机制，发现NLRP3炎症小体参与血栓形成的早期炎症环境，并受低氧诱导因子-1α 的调节。

4 小结

目前，血栓性疾病的治疗主要针对凝血过程，对炎症反应的控制与干预甚少。事实上，炎症反应参与血栓性疾病发生发展全过程，加重血栓性疾病的损伤，也是血栓性疾病致死率居高不下的重要原因。对NLRP3炎症小体的深入研究，探讨其介导的血栓性疾病的发生机制和炎症损伤，可为未来的血栓性疾病防治提供新的思路与方法。