组蛋白修饰在缺血再灌注损伤中的研究进展*

陈佳男，刘 维，张嘉轩，赵 珺**

(南通大学附属医院1 小儿外科，2 急诊医学科，南通 226001)

缺血再灌注(ischemic/reperfusion,I/R)指暂时消除器官的血供紧接着重建血供灌注及组织供氧。大多数情况下，I/R后组织器官的功能和结构可恢复，但有时出现加重情况，这一现象称为缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury,IRI)。IRI的病理生理学和发病机制复杂多样，缺血、缺氧、炎症、凋亡、线粒体功能障碍、氧化应激及多种信号通路均参与其过程。研究[1-2]表明IRI的组织和器官中出现表观遗传学改变。

表观遗传学是一门遗传学分支学科，在不改变潜在的遗传DNA序列的情况下发生基因表达的遗传变化，进行蛋白质复合物的翻译后修饰，主要包括乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、羰基化和糖基化及DNA甲基化[1-2]。组蛋白修饰是表观遗传学的重要组成部分，本文重点讨论目前研究热点IRI中组蛋白甲基化和乙酰化修饰调节和意义的最新进展，将有助于发现新的治疗方法。

1 组蛋白简介

基因组DNA在真核细胞核中以染色质形式存在，组蛋白是与DNA结合的碱性蛋白质，是构成染色质的主要蛋白质。真核生物组蛋白主要包括H1、H2A、H2B、H3和H4及其他组蛋白的变体。4种核心组蛋白H2A、H2B、H3和H4分别以二聚体形式结合构成八聚体(核小体核心)，供DNA缠绕，然后组蛋白H1连接DNA构成染色质的基本结构核小体[2]。

大多数组蛋白由一个球状区和突出于核小体外的组蛋白尾组成的碱性氨基酸组成。组蛋白H1的N端富含疏水氨基酸(如缬氨酸、异亮氨酸)，C端富含碱性氨基酸(如精氨酸、赖氨酸)，而H2A、H2B、H3和H4 4种组蛋白N端富含碱性氨基酸，C端富含疏水氨基酸。C端结构域与组蛋白分子间交互作用，参与DNA的缠绕。N端结构域富含赖氨酸，是高度精细的可变区域，协同其他调节蛋白和DNA作用。表观修饰位点主要位于组蛋白尾部，往往多个组蛋白尾的不同共价修饰组合形成一个连续修饰的过程，起协同或拮抗作用。组蛋白密码主要依据组蛋白中被修饰氨基酸的种类、位置和修饰类型构成[2-7]。在基因表达调控、DNA修复、有丝分裂及减数分裂等生物过程中组蛋白修饰发挥着不可替代的作用。

2 组蛋白修饰

2.1 组蛋白甲基化修饰 组蛋白甲基化修饰是组蛋白修饰的主要组成部分，在基因表达调控中发挥着重要作用。组蛋白甲基化修饰依赖组蛋白甲基化转移酶(histone methyltransferases,HMTs)完成，包括赖氨酸甲基化转移酶(histonelysine methytransferase,KMT)和精氨酸甲基化转移酶(protein arginine methyltransferase,PRMT)，已知甲基化位点包括赖氨酸残基(H3中的K4、K9、K23、K27、K36、K56、K79，H4中的K20，H1中的K26)和精氨酸残基(H3中的R2、R8、R17、R26，H4中的R3，H2A中的R11和R29)，其中H3K4、H3K36和H3K79位点的甲基化与基因转录的激活有关，H3K9、H3K27和H4K20位点的甲基化与基因转录的抑制有关[5-7]。组蛋白脱甲基化酶(histone demethylases,HDMs)的发现证明组蛋白甲基化是一可逆的过程，甲基化与去甲基化的动态变化发挥着不同的生物学作用[5,7]。

2.2 组蛋白乙酰化修饰 目前组蛋白修饰研究最多的是组蛋白乙酰化修饰，常发生于组蛋白H3、H4亚基末端的氨基酸残基上，具有转录激活及促进基因表达的作用。组蛋白乙酰转移酶(histone acetyl-transferases,HATs)和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases,HDACs)是调控机体组蛋白乙酰化水平的主要两类酶[3-8]。HATs广泛分布于各组织器官，通过升高组蛋白乙酰化水平激活基因、促进转录。而HDACs通过降低组蛋白乙酰化水平，凝聚染色质，继而抑制启动子与转录调控元件之间的结合，抑制基因转录。HDACs主要分4类：Ⅰ类(HDAC1-3和8)，Ⅱ类包括Ⅱa(HDAC4、5、7和9)和Ⅱb(HDAC6和10)，Ⅲ类包括SIRT1-7和Sir2，Ⅳ类(HDAC 11)。Ⅰ/Ⅱ/Ⅳ类是锌依赖性的，而Ⅲ类HDACs是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide-adenine dinucleotide,NAD)依赖[9]。组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor,HDACi)通过与HDACs内的Zn2+螯合，抑制HDACs活性，降低组蛋白去乙酰化水平，维持机体组蛋白乙酰化水平在正常范围内[5,8]。

3 心肌IRI

在体外循环下进行的冠状动脉搭桥术、心脏移植术等心血管系统手术中，心肌IRI是常见的并发症，甚至死亡。急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)的发病率逐年上升，及时恢复冠状动脉血流对限制心肌损伤和改善AMI后的临床结局至关重要，但缺血性心肌的再灌注这一过程本身可引起损伤并加速心肌坏死，即心肌IRI[10-11]。AMI期间的I/R约占最终梗死面积的一半，目前针对IRI的有效疗法仍无实质性进展[12]。组蛋白修饰在心肌IRI中的研究作为一新兴领域，有望为其机制研究带来新的思路。

3.1 组蛋白甲基化修饰与心肌IRI心脏缺血预处理(ischemic preconditioning,IPC)指短暂的、非致死性的缺血和再灌注反复发作，可保护心脏免受长时间的缺血性损伤和再灌注损伤，减小梗死面积并改善心脏功能[13-14]。O.GIDLÖF等[13]对接受IPC的小鼠进行心脏活检并定量甲基化组蛋白(H3K9me2、H3K27-me3和H3K4me3)的水平，结果显示H3K9me2水平增加，并通过甲基转移酶G9a抑制转录，即G9a在调节心脏自噬和IPC的心脏保护作用中具有重要作用。M.DAS等[15]通过建立野生型和caveolin-1基因敲除小鼠模型，对心脏进行预处理和I/R，发现caveolin-1敲降似乎通过抑制组蛋白乙酰化、刺激组蛋白甲基化，消除或降低了IPC诱导的心脏保护作用，即caveolin-1通过表观遗传调控诱导心脏保护作用。

3.2 组蛋白乙酰化修饰与心肌IRI研究[12]表明缺血性心脏病与HDACs诱导的组蛋白去乙酰化水平有关，在心肌再灌注时使用HDACi具有强大的心脏保护作用。T.C.ZHAO等[16]采用小鼠离体心脏灌注模型研究发现Ⅰ型和Ⅱ型HDACs抑制剂曲古抑菌素A(trichostatin A,TSA)通过激活p38和Akt1，抑制HDACs活性，从减少心肌梗死面积、防止梗死心肌重塑等方面进行心肌保护。L.ZHANG等[9]首次证明HDACi减弱了活化的HDAC4对I/R损伤的有害作用，即活化的HDAC4是心肌IRI的关键调节剂。心肌IPC能够激活内在的信号传导通路，保护心肌免受IRI，主要涉及IPC时激活Ⅲ类HDACs成员SIRT1活性。T.YAMAMOTO等[17]利用SIRT1抑制剂利福霉素抑制SIRT1介导的去乙酰化作用，证明SIRT1介导的IPC心肌保护作用。

Ⅰ、Ⅱ类HDACs对心脏功能有害，而Ⅲ类HDACs被认为对心脏保护有益，因此发明抑制Ⅰ类和Ⅱ类HDACs或激活Ⅲ类HDACs的新型分子为治疗心脏IRI带来希望。

4 组蛋白修饰与脑IRI

脑是对缺氧最敏感的器官，脑组织缺血会引起局部脑组织及功能的损害，损伤程度与缺血时间长短及残存血流量多少有关，长时间的完全缺血或严重缺血导致脑组织梗死。在当今的生活方式和社会经济压力下，缺血性卒中是导致死亡和长期残疾的主要原因，其病理生理学非常复杂，涉及多个相互关联的过程，这里主要介绍组蛋白修饰在缺血性卒中中可能存在的机制，为治疗提供新型药物靶标。

4.1 组蛋白甲基化修饰与脑IRI在缺血脑组织中，基因谷氨酸受体2被抑制与甲基化组蛋白H3K9脱乙酰化相关，且在海马CA1神经元中H3K9甲基化高于其启动子区域。文献[18]报道在体外缺血模型中，组蛋白甲基化水平上抑制转录阻遏物可促进脑缺血体的神经元存活，抑制组蛋白甲基转移酶(如SUV-39H1和G9a)可显著改善缺氧缺糖(oxygen-glucose deprivation,OGD)后的神经元存活。P.JHELUM等[19]在CD1小鼠颈内动脉闭塞(internal carotid artery occlusion,ICAO) 模型的纹状体中诱导轻度至中度脑缺血性损伤，发现在ICAO后的不同时间间隔，许多HMTs和少量HDMs表现出失调，受累纹状体区域的转录抑制性H3K9me2显著减少。若在小鼠卒中诱导过程中，应用赖氨酸脱甲基酶抑制剂可恢复受影响的纹状体中受干扰的H3K9me2水平，减少神经功能缺损及凋亡细胞死亡。

4.2 组蛋白乙酰化修饰与脑IRI在局部缺血状态中，组蛋白H3和H4乙酰化水平普遍下降抑制转录，因此通过激活HATs或抑制HDACs来恢复组蛋白乙酰化水平，进一步促进基因转录，可能会改善病情[19]。HDACs在中风后的氧化应激中发挥不同的作用。缺血性中风迅速引起组织梗死，紧接着的几个小时损伤扩散到相邻的组织形成过渡区即半暗带。光化学诱导的大鼠脑缺血性中风模型中，缺血后4～24 h半暗带中HDAC1和HDAC2的表达增加。在神经元中HDAC1从神经核到细胞质重新分布，而HDAC2仅位于细胞核中；在星形胶质细胞中HDAC1的表达和定位均未发生改变，而HDAC2在缺血性中风过程中被观察到[20-21]。在瞬态大脑中动脉缺血(middle cerebral artery occlusion,MCAO) 模型和长时间OGD模型中，Ⅲ类HDACs中的SIRT1表达的减少，而短时间OGD和中度损伤缺血SIRT1的表达未发生改变[22-23]。对中风的表观遗传机制的研究尚处于起步阶段，表明在不同水平发生的表观遗传机制可能涉及缺血过程，为更好地了解中风病理学及研究新的治疗策略提供了广阔前景。

5 组蛋白修饰与肾IRI

肾脏是机体高灌注的一个器官，在临床常见手术，如肾移植、肾缺血和体外震波碎石等，都可能出现肾IRI，进展为缺血性急性肾功能衰竭(acute kidney injury,AKI)，甚至出现终末期肾脏疾病及推动慢性肾脏疾病的发生和发展，最终引起死亡。最近的研究[7,24]表明表观遗传调控在肾IRI及AKI中的新兴作用，但对潜在分子机制报道极少，因此探究肾IRI及AKI这一病理现象具有重要意义。

5.1 组蛋白甲基化修饰与肾IRI目前国内外报道组蛋白甲基化在肾IRI中的作用研究较少。D.MAR等[24]通过Matrix CHIP(基于微孔板的染色质免疫沉淀测定法，可同时检测各种组蛋白修饰与多个基因的关联)检查并比较了AKI中Tnf、Ngal、Kim-1和Icam-1基因的组蛋白修饰模式，实验结果表明在I/R后26～74 h内，所有4个基因位点的组蛋白甲基化均增加，仅在Tnf基因上诱导组蛋白乙酰化。与对侧肾脏相比，缺血后肾脏中TNF-α 基因的第一个和最后一个外显子的H3K4三甲基化(H3K4m3)水平更高。在HMG-CoA还原酶(HMG-CoA reductase,HMGCR)基因上H3K4m3的水平增加了3～4倍，导致AKI患者中HMGCR活性的增加[7,25]。目前，尚不清楚组蛋白甲基化的调节是否会改变肾IRI后的发病机制。

5.2 组蛋白乙酰化修饰与肾IRI组蛋白乙酰化和脱乙酰化参与I/R诱导的肾损伤。乙酰化赖氨酸主要位于肾小管的细胞核中，在肾IRI中乙酰化阳性肾小管明显增加[26]。有报道[27]证实在肾脏IRI中HDAC1表达降低，但HDAC2的水平未受到影响。T.MARUMO等[28]揭示小鼠肾I/R后近端肾小管细胞中组蛋白乙酰化水平短暂降低，在恢复阶段HDAC5表达降低致组蛋白再乙酰化，并在近端肾小管诱导骨形态发生蛋白7(bone morphogenetic protein-7,BMP7)的表达。BMP7是肾脏发育过程中肾生成的关键因子，在肾IRI后的近端小管细胞中BMP7被强烈诱导促进肾小管上皮细胞的再生和修复，暗示通过抑制HDAC5来增强BMP7表达的潜在治疗策略。

总之，组蛋白乙酰化在肾IRI中起至关重要的作用，通过靶向HDAC调节组蛋白乙酰化有望在AKI的治疗中发挥作用，需进一步研究参与AKI过程的特定同工型HDAC和新型HDACi。

6 组蛋白乙酰化修饰与肝IRI

肝IRI是肝脏外科手术、创伤和肝移植过程中发生肝脏功能损害、肝功能衰竭的重要原因之一，与术后死亡率有关。肝IRI可能导致肝细胞损伤、氧化应激、炎症和肝功能障碍，甚至是移植后的急慢性排斥反应。研究[29-30]表明，肝脏IRI程度与缺血的类型(冷或热)、程度(部分或全部)、持续时间有关，但肝IRI导致的不良后果仍是临床实践中尚未解决的主要问题，因此最小化肝IRI具有重要的临床意义。表观遗传调控是肝IRI机制研究的新兴领域，目前主要涉及组蛋白乙酰化和去乙酰化。

研究[29]表明肝I/R导致组蛋白乙酰化显著降低，内源性HDACi丁酸酯通过抑制HDAC和诱导热休克蛋白70发挥保肝作用。J.EVANKOVICH等[31]证实肝脏I/R后肝细胞中核HDAC1和HDAC4活性的降低，乙酰化组蛋白H3水平上调的同时细胞外高迁移率族蛋白box-1(high mobility group box-1,HMGB1)乙酰化和释放增加，激活I/R损伤后的炎症途径。加利福尼亚大学肝与胰腺移植中心[32]首次证实SIRT1通过抗炎作用和抗凋亡功能发挥肝保护作用。SIRT6是Ⅲ类组蛋白脱乙酰基酶，已被证实参与肝脏的多个代谢过程，最近研究[33]发现在肝IRI过程中SIRT6激活减轻了肝脏损伤，潜在的机制涉及维持氧化稳态和线粒体功能，然后抑制炎症反应和丝裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号转导，并最终减弱细胞凋亡和自噬相关的肝细胞死亡。

除组蛋白乙酰化和去乙酰化，肝IRI中组蛋白其他修饰的研究仍处于空白阶段，深入表观遗传学研究有望为肝IRI机制及治疗带来新的突破。

7 组蛋白乙酰化修饰与肺IRI

肺IRI是肺移植、肺栓塞、失血性休克、体外循环手术等临床情况常见的并发症，是一种急性无菌性肺损伤。通常发生在肺移植后72 h内，I/R诱导的肺损伤出现非特异性肺泡损伤、肺水肿和低氧血症，导致早期肺移植后功能障碍。肺IRI的病理生理学非常复杂，涉及活性氧的产生、钠泵的失活、细胞内钙超载、铁的释放、促炎性介质的释放、细胞凋亡、激活白细胞等，关于表观遗传学研究很少，是目前机制研究的新方向[34-36]。

组蛋白乙酰化和去乙酰化参与肺IRI的调控。M.W.CAUSEY等[34]利用猪进行I/R实验，结果证实丙戊酸(valproicacid,VPA)能降低I/R诱导的肺损伤，可能与肺中热休克蛋白70水平增加有关。随后有报道[35]在离体灌注的大鼠肺I/R模型，肺组织中乙酰化组蛋白H3表达降低，应用VPA治疗可减弱肺损伤，这种保护机制至少部分归因于VPA诱导的血红素加氧酶表达增强。研究[36]表明TSA增加肺IRI中组蛋白H3的乙酰化和丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1表达，并抑制核因子-κB、丝裂原活化蛋白激酶和凋亡信号通路，从而对I/R诱导的肺损伤发挥保护作用。组蛋白去乙酰化参与I/R诱导的肺损伤发病机制，但仍需进一步研究提供更多的支持，以更好地了解各个同工型HDACi的保护机制。

8 组蛋白与肠IRI

肠IRI常在坏死性小肠结肠炎、肠扭转、肠套叠、肠系膜缺血、肠梗阻、出血性休克等情况下发生，肠道IRI导致肠局部损伤的同时，释放大量介质进入循环系统，导致远处器官功能衰竭，如急性肺损伤(acute lung injury,ALI)。文献[34-35]报道VPA在各种缺血再灌注模型中具有细胞保护、抗炎和抗凋亡特性，被确认为HDACi，可快速增加核蛋白和非核蛋白的乙酰化来调节关键的细胞机制。K.KIM等[37]通过夹闭大鼠肠系膜上动脉构建肠I/R模型，应用VPA治疗可改善存活率，还通过抗氧化和抗炎作用减轻ALI。

9 展望

尽管常见机体重要器官(如心、脑、肾、肝、肺)的临床前研究中IRI的发病机制和分子基础方面已经取得了重大进展，但这些发现转化为缺血性疾病的临床应用仍需进一步探索。相较于其他器官，表观遗传调控在肠缺血再灌注损伤中的研究几乎处于空白阶段，仅1篇应用HDACi治疗可提高肠IRI模型存活率的报道[37]，但关于其机制研究仍是难题。微生物群是现今热点话题，到目前为止，尚无直接证据表明表观遗传学在塑造宿主-微生物群相互作用中的作用，但是存在很多关于潜在的表观遗传机制如何调节宿主与微生物之间的生物相互作用的迹象。有专家提出微生物群甚至可以被视为表观遗传实体本身，因为与经典表观遗传机制(如组蛋白修饰，DNA甲基化和ncRNA介导的调控)相比，它在与宿主的相互作用中表现出相似的特征。肠道菌群是人体微生物群的重要组成部分，如果能将肠道菌群与肠IRI、表观遗传学联系起来，或许能带来一个新的研究方向。

表观遗传调控与IRI之间的联系是当前研究热点，现阶段研究成果主要涉及DNA甲基化、组蛋白乙酰化和甲基化，了解表观遗传调控的最新进展有助于探索治疗这些疾病的表观遗传靶点。HDACs是调节机体组蛋白和其他重要细胞蛋白乙酰化水平的关键酶，其在IRI疾病中的作用逐渐被发现，随着对各个同工型HDACi的不断深入研究，逆转脏器IRI的作用机制逐渐被发现，可能会成为未来诊断、治疗IRI新的治疗方向。