BVDV JZ05-1 分离株基因组非编码区结构特征及编码区突变规律分析

李庆超，刘艳环，李海涛，朱言柱，肖家美，赵艳，苗利光※

（1.山东师范大学，山东 济南 250014；2.中国农业科学院特产研究所，吉林 长春 130112）

牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）是引起牛腹泻的主要病原，主要宿主为牛、羊、猪和鹿等，造成牛病毒性腹泻/粘膜病。目前，该病毒在世界范围内广泛分布。牛病毒性腹泻病毒基因组为12300 nt 左右的正链RNA，无Poly（A）尾[1]，含有1个开放阅读框，编码1个约4000个氨基酸的多聚蛋白[2]。病毒进入细胞后，基因组首先指导合成1个多聚蛋白，后者随后被加工成成熟的病毒蛋白。可读框两侧具有的5'和3'端非编码区对病毒RNA 基因组的转译起始和稳定性具有重要意义[3-4]。根据BVDV 基因组5'端序列差异，可将其分为1、2 两种基因型，每种基因型下分为若干个亚型，主要有4种，2a1、2a2、2b1和2b2[5]。

目前，对该病防治的主要手段是疫苗免疫和淘汰持续感染牛。BVDV 疫苗以BVDV-1 株为主，但严重的临床症状和急性感染多由BVDV-2 引起，BVDV-1疫苗不足以保护BVDV-2型病毒所引起的急性感染[6-8]，所以亟待加强BVDV-2 型疫苗的研究。BVDV JZ05-1毒株为中国农业科学院特产研究所预防兽医研究室分离的1 株牛源BVDV，鉴定为BVDV-2 型毒株，在牛胎肾细胞（madin darby bovine kidney cells）上可以稳定增殖传代，产生典型的细胞病变。早期动物实验表明，JZ05-1 是弱毒株，攻毒后鼻拭子分离病毒不返强，能够产生很好的免疫保护作用。JZ05-1 毒株全基因组序列与BVDV-2 型其他毒株的全基因序列有较大差异[9]，为进一步确定该病毒的特性，本试验通过预测5'、3'-UTR 二级结构、毒力标记、结构蛋白编码区突变以及RdRp 同源建模等方法对该病毒的基因进行分析，详细确定该毒株与其他2 型毒株的关系、探讨非编码区结构特征以及编码区突变规律，为疫苗研制提供理论基础。

1 材料

1.1 毒株及基因组序列

BVDV JZ05-1 分离株基因组序列GenBank 登录号为GQ888686；其它基因序列所属BVDV 分离株名称有BVDV-2：V-FLL、NY'93、NY'97、XJ-04、4C5174、104/98、SW90、17011、BS-95-II、Giessen-1、Soldan、VS-63、VS-123.4、34b、C413、bv54、p11Q、1373、P24515；BVDV-1：NY1、ZM-95、C24V、NADL、Singer、Osloss、SD1、KE9、VEDEVAC、CP7-5A、ILLNC。

1.2 生物信息学软件

生物信息学软件主要有Vector NTI Advance 11（Invitrogen）、CLC RNA Workbench 4（CLCBio）、MEGA 4（the biodesign Institute,arizona state university）、Swiss-PdbViewer（the swiss institute of bioinformatics）等由中国农业科学院特产研究所经济动物疫病研究室提供。

2 方法

2.1 非编码区RNA 二级结构预测

使用Vector NTI Advance 11 查找BVDV JZ05-1全基因组序列开放阅读框，确定病毒3'-UTR 及5'-UTR区域；使用AlignX 程序对NY'93、p11Q、XJ-04 非编码区进行多序列比对，并使用CLC RNA Workbench 4 预测非编码区RNA 二级结构，进而探讨非编码区RNA一级结构与二级结构间的关系。

2.2 结构蛋白编码区突变分析

以BVDV-2 标准株NY'93 毒株、加拿大p11Q 毒株、我国XJ-04 株及JZ05-1 毒株为研究对象，统计比较包括BVDV 结构蛋白和部分p7 蛋白在内的可读框前4kb 碱基变化。

2.3 同源建模及蛋白突变分析

选取BVDV 非结构蛋白NS5B（RNA 依赖RNA聚合酶，RdRp）为代表，通过Swiss-model 服务器，以已发表的BVDV RdRp（PDB：1s4f）结构为基础，进行同源建模。利用Swiss-PdbViewer 生物信息学软件进行分析。

2.4 毒力标记分析

选取JZ05-1 毒株的5'-UTR 序列与BVDV-1 型毒株Osloss、SD1、NADL、NY1 和BVDV-2 型强度毒株NY'93、890、17583、23025 及BVDV-2 型弱毒株17011、7937、713、5521 的5'-UTR 序列进行毒力标记比较，分析JZ05-1 毒株毒力位点碱基类型与毒力的关系。

3 结果

3.1 非编码区RNA 二级结构

选取BVDV-2 代表株NY'93 以及我国2 型毒株XJ-04 及本实验所用JZ05-1 毒株的5'、3'-UTR，利用RNA 生物学分析软CLC RNA Workbench 4 预测RNA二级结构发现，3个2 型毒株间具有明显的保守二级结构；5'-UTR 可分为Ⅰ区、Ⅱ区和Ⅲ区3个结构域（图1A），其中，Ⅰ区和Ⅲb～Ⅲe 区在BVDV 病毒中结构最为保守；Ⅱ区结构可变性强，3个毒株间Ⅱ区结构差异明显；JZ05-1 在Ⅲa 区与其他2个毒株结构具有明显差异，在150 nt 左右区域形成1个独特的颈环结构。结合序列比对可知，5'-UTR 具有1个可变区，即Ⅱ区，造成RNA 二级结构较大的变化；其他碱基突变则主要分布于RNA 二级结构颈环交界处，造成loop 环大小的细微变化，基本不影响RNA 二级结构。

BVDV 3'-UTR 与5'-UTR 相比，结构保守性差。JZ05-1 的3'-UTR 可分为3个独立的结构区域，但其他毒株不具备此特征（图1B）。JZ05-1 与NY'93 在150～200 nt 区形成极其相似的折叠，而与XJ-04 株在40 nt 左右处形成相似的折叠区域。通常3'-UTR 结构可变性强，但JZ05-1 结构与NY'93 更相似。结合序列比对发现，3'-UTR 可变区存在于JZ05-13'-UTR 第一折叠区，同样，可变区外的碱基突变主要分布于颈环交界处。

图1 JZ05-1 毒株5'-UTR（A）和3'-UTR（B）非编码区二级结构Fig.1 Secondary structure of 5'-UTR(A)and 3'-UTR(B) of JZ05-1 strain

3.2 结构蛋白编码区序列突变

选取JZ05-1 毒株结构蛋白编码区共4 kb 序列作为分析对象，结合我国XJ-04、美国NY'93 以及加拿大p11Q，分析其毒株间差异碱基位点、碱基突变类型、碱基位置以及氨基酸突变类型。4 株BVDV-2 毒株在结构蛋白编码区共有661 处差异，占4 kb 碱基的16.5%，其中，多数为1个毒株特有或者2个毒株共有碱基。JZ05-1 特有碱基位点为201 处，XJ-04 特有碱基位点为174 处，中国JZ05-1 和XJ-04 共有的与另外2 株美洲毒株间差异为117 处，这些碱基突变位点占全部碱基突变位点的74.4%，美洲毒株NY'93 及p11Q 的特有碱基位点分别仅为66 处和42 处（图2A）。碱基突变主要发生于氨基酸密码子的第3 位，共377 处，占全部突变的57.0%（图2B）。突变类型主要为嘌呤间（A/G）或者嘧啶间（U/C）的替换，其中嘌呤碱基替换268 处，嘧啶碱基替换282 处，分别占全部碱基突变的40.5%和42.7%（图2C）。4个毒株间结构蛋白编码区编码氨基酸差异181 处，占氨基酸残基总量的13.5%。不带电氨基酸之间的替换占总量的61.3%，其中，以侧链较小的非极性氨基酸间替换最多，共有64 处（图2D）。

图2 结构蛋白编码区突变分析Fig.2 Mutations in structure protein coding region

3.3 RdRp 同源建模

根据已测的BVDV RdRp 蛋白晶体结构（1s4f），利用Swiss-model 服务器，对JZ05-1RdRp 进行同源建模[10-12]。利用Swiss-PdbViewer 生物信息学软件显示预测结果，并与原模版进行比较[12]。BVDV 的RdRp 具有核酸复制酶典型的手状结构，具有“手掌”、“拇指”以及“四指”结构域，活性部位位于手掌内侧，由“拇指”及“四指”结构域包围，是典型的RNA 合成酶构型。但与丙型肝炎病毒（HCV）等的RdRp 分子比较，BVDV RdRp 的N 端具有1个较长的突出结构域。氨基酸残基可及性和氨基酸差异标记晶体结构预测模型结果表明，差异氨基酸主要存在于RdRp 蛋白表面可及性好的区域，位于疏水区以及蛋白内部活性中心区域的氨基酸位点极少突变，结果见图3。

图3 BVDV RdRp 三维结构模型Fig.3 Structure of BVDV RdRp. There are taken on a different color acceding to accessibility and alignment diversity

3.4 毒力标记

按照Christina L[13]的BVDV 毒力标记规律，强毒株在219 和278 位分别为U 和C 碱基，弱毒株为C 和U 碱基（图4A）。JZ05-1 毒株分析结果发现，219 位为弱毒标记（图4B），278 位为强毒株标记（图4C），说明JZ05-1 毒株毒性不完全符合BVDV 毒力标记规律。

4 讨论与结论

BVDV 属正链RNA 病毒，仅转染基因组RNA 进入细胞即可产生具有感染性的成熟病毒粒子，因此病毒基因组RNA序列几乎可以代表该病毒的全部生物学特性。该病毒基因组共有3 部分组成，5'-末端茎环结构在RNA 翻译起始和有效复制过程中起关键作用[14-15]；单个大的ORF 编码1个多聚蛋白，直接影响病毒抗原性、致细胞病变以及病毒复制能力；ORF 之后，3'-NCR 的具有1个可变区和1个保守的3'-末端茎环结构以及1个单链区，对病毒RNA 稳定性以及负链RNA合成至关重要[16-17]。

非编码区是RNA 基因组表达及复制所必须的结构，有重要的初级和二级结构元件，可与病毒及宿主蛋白因子结合[18]。分析表明，BVDV-2 型毒株在5'-UTR具有保守二级结构区域Ⅰ区和Ⅲb～Ⅲe 区，后者是IRES 所在处，介导病毒RNA 5'-帽子非依赖的翻译起始。毒株间Ⅱ区的二级结构差异较大，且具有较高的可变性，JZ05-1 毒株在Ⅲa 区与其他毒株存在差异，具有独特的二级结构。3'-UTR 涉及RNA 翻译的正确终止以及病毒RNA 稳定性和复制的完成。通过研究比较表明，BVDV 3'-UTR 虽然序列具有较高的保守性，但不具有明显的保守二级结构，因此，3'-UTR 可能主要以初级结构元件发挥其作用，这一点与5'-UTR 不同。JZ05-1 的3'-UTR 分别与NY'93 和XJ-04 具有相似之处，与美国NY'93 株更接近。

图4 BVDV-2 位于5'-UTR 的毒力标记Fig.4 Virulence markers in the 5'-UTR of BVDV-2

早在1998年，Christina L 等人分析了BVDV-1 以及BVDV-2 数十株强、弱毒株5'-UTR 序列，总结了位于Ⅲ区的2个毒力标记发现，强毒株在219 和278 位分别为U 和C 碱基，而弱毒株为C 和U。本试验所用JZ05-1 经实验证明为1 株弱毒株，分析结果发现，其在219 位为弱毒标记，但在278 位为强毒株标记，由此可见，JZ05-1 不符合上述毒力标记结论。通过将非编码区二级结构和多序列比对结合的研究表明，碱基突变除发生于5'-UTR Ⅱ区以及3'-UTR Ⅰ区可变区外，多数位于颈环结构交接处，这些突变的存在基本不影响RNA 保守二级结构，特别是5'-UTR 的Ⅲ区。然而上述两个毒力标记恰位于这些容易突变的区域，这些突变如何影响病毒毒力目前还不清楚，但是分析结果表明，278 位做为毒力标记的结论不适用于JZ05-1毒株。

结构蛋白决定病毒粒子组成、病毒吸附侵入以及抗原性，发生突变会直接影响疫苗毒株与野毒交叉保护效应。同时，包膜蛋白虽然是该病毒突变能力最强的蛋白，但其可变性要受到自然选择的限制。本试验以病毒结构蛋白编码序列区为研究对象，探讨病毒突变类型以及位置，结果显示，分离自我国的2 株BVDV-2 毒株具有大量的独特碱基，与美洲NY'93 以及p11Q 毒株差异很大，这可能造成国外BVDV-2 疫苗用于我国BVDV 防控不能达到良好效果的原因。通常情况下，碱基突变主要发生在密码子第3 位，以A/G 以及U/C间的替换为主，不会造成氨基酸种类的改变，因此，病毒突变碱基的分布特征造成碱基突变大部分为中性突变。氨基酸种类发生变化的突变则主要集中于不带电氨基酸的替换，特别是小氨基酸残基的非极性氨基酸。BVDV 属RNA 病毒，具有高度可变性，但是其宿主是以DNA 为遗传物质的哺乳生物，遗传稳定性极强，这造成病毒生存环境的稳定，由此产生的自然选择压力限制了其可变性，只有大多数中性突变以及次要氨基酸的突变被保留下来。但是，为何我国BVDV-2 毒株与其他国家和地区分离株具有较大差异，还需要进一步研究。

BVDV 非结构蛋白与病毒蛋白加工、致细胞病变的产生以及RNA 复制密切相关。研究表明，NS2-3 裂解是RNA 复制所必需的，且被极微量的细胞伴侣分子Jiv 所调控。ncpBVDV 感染早期，NS2-3 几乎完全裂解，致使产生NS3 并参与RNA 复制。感染后期Jiv 含量有限，NS2-3 自剪切加工不能进行，NS2-3 含量提高且病毒RNA 合成效率下降[19]。病毒基因组重组插入病毒（Npro、NS2）或者宿主基因（Jiv、Ub）片段造成NS2-3 的组成性切割，使病毒可无限制地产生NS3 蛋白，RNA 复制得不到控制，继而引发细胞病变以及凋亡。JZ05-1 毒株基因组不具有插入和缺失，是1 株无基因重组但具有cpe 的BVDV-2 毒株。此种cpeBVDV 分离株，NS2-3 自切蛋白酶活性增加是因为在NS2 基因上的点突变积累所造成的[20]，至于是哪些氨基酸的突变导致其自切酶活性增加，还有待于进一步研究。