致仔貉腹泻病原大肠杆菌的分离鉴定

严世杰，芮萍，宋涛，付琦媛，王春芳，马增军

（河北科技师范学院，河北 秦皇岛 066000）

毛皮动物人工饲养为高效益养殖行业。毛皮动物养殖在我国起步较晚，但发展很快，目前国内毛皮动物养殖分布在15个省（区），河北省拥有多个“国家级标准化特种动物养殖示范区”和“裘皮服装加工出口基地”，毛皮动物养殖规模大，效益高[1]。但当前由于缺乏与之相适应的技术人才及具可操作性的标准化、规范化疫病防控技术体系，加之病毒的变异，病原多重感染，非典型化、亚临床病征增多，仔貉发生腹泻的病例屡见不鲜，严重限制了毛皮产业的健康快速发展。临床研究发现引起仔貉腹泻的病因复杂，气候环境因素、饲喂不科学和病原感染等因素均可引起仔貉发病，病原感染主要包括病毒、细菌和寄生虫感染[2]。其中，仔貉的细菌性腹泻流行范围较广，菌株易产生耐药性，引起仔貉腹泻的细菌主要包括大肠杆菌、魏氏梭菌和沙门氏菌等[3,4]。多数貉患腹泻病具有传染性，导致仔貉生长缓慢、营养不良，进而影响毛皮质量，造成严重的经济损失。

为了解秦皇岛地区导致仔貉腹泻的主要病原菌流行分布情况，本实验室分别采集来自秦皇岛地区5个规模化毛皮动物饲养场的10 只腹泻病死仔貉，进行细菌分离鉴定、毒力基因检测、致病性试验和药敏试验，旨在确定致病菌株的耐药性与致病性，以期为预防、控制该地区仔貉细菌性腹泻流行与敏感药物的筛选提供理论依据。

1 材料

1.1 试验动物

30 只6～8 周龄雌性Balb/c 小鼠（约25 g），购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.2 主要试剂

普通营养琼脂培养基、鲜血营养琼脂培养基、麦康凯培养基、伊红美蓝培养基及LB 肉汤（北京路桥生物技术有限公司）；ID32 GN 革兰氏阴性杆菌鉴定试条（法国梅里埃公司）；DL2000 Marker 和2 Es Taq MasterMix（北京赛百盛基因技术有限公司）；药敏纸片（北京天坛药物生物技术开发公司）。

2 方法

2.1 细菌分离培养及生化特性鉴定

无菌采集腹泻仔貉小肠内容物、肠系膜淋巴结、肝脏和脾脏样本，划线接种于麦康凯琼脂培养基，置37℃恒温培养箱，培养24～48 h 后观察菌落特征，挑取红色单个菌落接种于普通营养琼脂培养基进行纯化，将纯化菌株接种于伊红美兰琼脂培养基和鲜血营养琼脂培养基，经37 ℃培养18～24 h 后观察其溶血性等，并将疑似菌株用ID32 E 肠道杆菌鉴定试条进行生化鉴定。

2.2 小鼠致病性试验

将30 只Balb/c 小鼠随机分成6 组，每组5 只。将分离获得的5 株优势菌株分别接种于LB 液体培养基，37 ℃增菌培养18 h，分别接种至各实验组小鼠，实验组每只小鼠腹腔注射菌液0.2mL（约含菌3.0108CFU/mL），同时设置对照组，对照组每只小鼠腹腔注射灭菌LB培养基0.2 mL。各组小鼠单独隔离饲养，观察发病和死亡情况，对死亡小鼠进行剖检，无菌取其肝、脾、肺组织进行细菌分离鉴定，确定菌株致病性。

2.3 药敏试验

选择常用的阿莫西林、四环素、复方新诺明、环丙沙星、氟苯尼考、克林霉素、头孢氨苄、头孢唑林、头孢噻呋、庆大霉素、多粘菌素和强力霉素等12种抗生素的药敏纸片，按照美国临床检验标准委员会（NCCLS）推荐的标准用K-B 纸片法进行试验操作和结果判断[5]。

2.4 大肠杆菌毒力基因PCR 检测

2.4.1 引物合成

按GenBank 公布的基因序列，参照文献[6,7]中有关致病性大肠杆菌的9个毒力相关基因iutA、papC、afa、fyuA、astA、escV、eaeA、ler、irp2，共设计9 对引物，用于鉴定大肠杆菌毒力因子基因表型，引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成，见表1。

表1 引物序列和扩增条件Table 1 primer sequence and amplification program

2.4.2 PCR 扩增

利用水煮模板法提取细菌DNA，以DNA 为模板，用本研究设计合成的9 对大肠杆菌毒力基因特异性引物对分离菌株进行毒力因子基因表型检测。PCR 反应扩增体系为：DNA 模板4L，2 Es Taq MasterMix 预混液25L，上下游引物各1L，去离子水补足至50L。PCR 扩增程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，根据各对引物的退火温度退火30 s；72 ℃延伸1 min，进行35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR 产物经由1%琼脂糖凝胶电泳试验进行检测。

3 结果分析

3.1 细菌分离鉴定结果

从10 只以腹泻为主病死仔貉的小肠和肝脏样本培养物中分离获得5 株细菌，分离菌株在鲜血平板培养基上生长良好，呈 溶血；在麦康凯琼脂培养基呈红色菌落，在伊红美兰琼脂培养基上形成具有金属光泽的中等大小表面光滑菌落，革兰氏染色镜检为革兰氏阴性杆菌。

3.2 生化鉴定结果

5株分离菌株经NEWATB微生物鉴定分析系统检测，结果显示，生化鉴定结果与大肠埃希菌一致，见表2。

表2 分离菌株生化特性鉴定结果Table 2 Identification results of biochemical characteristics of the isolated strains

3.3 致病性试验

5 株大肠杆菌分离物接种Balb/c 小鼠，3 h 后小鼠出现精神萎靡、食欲减退及反应迟钝等症状，试验组小鼠在14～72 h 内全部发病死亡，剖检可见小鼠肠道出血，肝脏轻微肿大。取死亡小鼠的小肠、肝脏、脾脏及肺脏样本，划线接种于麦康凯琼脂培养基，37 ℃培养24 h后在麦康凯琼脂培养基上生长出边缘整齐、表面光滑的红色圆形菌落（见图1），经生化鉴定与原接种菌生化特性一致。对照组小鼠生长正常，全部存活且未出现任何症状。

图1 分离细菌的菌落形态Fig 1 Colonymorphologyofisolatedbacteria

3.4 药敏试验结果

药敏试验结果显示，分离菌株对临床常用抗菌药物产生高度耐药性，而且以多重耐药为主。对阿莫西林、四环素、复方新诺明、环丙沙星、氟苯尼考和克林霉素的耐药率高达80%～100%，对头孢菌素类、庆大霉素、多粘菌素和强力霉素仍保持一定的抗菌活性，其中多粘菌素敏感性最高为100%，抗菌效果良好，结果见图2。

图2 药敏试验结果Fig 2 The result of antimicrobial susceptibility testing

3.5 大肠杆菌毒力基因检测结果

对5 株分离菌株进行了9种毒力基因的PCR 检测及测序鉴定，检测结果见表3。ler、irp2、iutA、fyuA、astA、papC 6种基因检出率分别为100%、100%、40%、40%、20%、20%。

表3 5 株大肠杆菌毒力基因检测结果Table 3 Detection results of virulence genes of 5 isolated strains

4 讨论

大肠杆菌是广泛存在于人和动物的肠道及土壤、水中的一种重要的人畜共患病原菌[8]，引起人和动物发生腹泻的大肠杆菌被称为致泻性大肠杆菌，准确鉴定致泻性大肠杆菌对于腹泻病的治疗和防控尤为重要。血清型鉴定是临床上区分大肠杆菌的传统方法，但存在工作量较大、可重复性低的弊端。致泻性大肠杆菌往往携带特定的毒力因子，利用PCR 扩增技术对特定的毒力因子进行检测，有效提高检测率的同时亦能极大地缩短检测时间[9-11]。

貉源大肠杆菌可引起不同日龄仔貉发生急性或慢性肠道传染病，仔貉、幼貉尤为易感，病貉多表现以腹泻和败血症为主的临床症状，呼吸系统及中枢神经系统亦受到不同程度的侵害，严重者可导致急性死亡[12,13]。本研究在秦皇岛市的5个规模化毛皮动物饲养场的腹泻病死仔貉中分离出5 株优势菌株，生化鉴定结果显示导致仔貉腹泻的主要病原菌为大肠杆菌。毒力因子检测结果发现分离出的5 株与腹泻仔貉的大肠杆菌均携带ler、irp2 毒力基因，部分菌株携带iutA、fyuA、astA、papC 毒力基因，结合致病性试验结果发现，5 株大肠杆菌具有较强致病性，对毛皮动物的生长发育存在较大威胁，需引起广大养殖户的高度重视。

近年来，由于抗生素的滥用以及细菌对抗生素类药物的选择压力增加导致大肠杆菌对常用的抗生素产生了不同程度的耐药性，此外，细菌的很多耐药基因甚至可通过食物链传递给人类，对人类的生命健康造成严重威胁[14]。Zhang 等[15]人在2008-2015年间对我国多个省区的一万余份猪、鸡样品进行检测，发现大肠杆菌对氟苯尼考、头孢噻呋等多种抗生素的耐药性呈逐年增加趋势，对氨苄青霉素、磺胺异噁唑及四环素3种抗生素的耐药性甚至超过80%，表明抗生素耐药性的问题日益严重。本研究通过药敏试验对分离到的5 株大肠杆菌进行检测发现，其对多粘菌素和头孢菌素类药物保有抗菌活性，对阿莫西林、四环素等抗生素均产生了强耐药性，且耐药谱复杂，提示我们在防治大肠杆菌腹泻病时应注意规范抗生素的使用，选用敏感药物并定期更换药品种类，防止产生耐药性。

仔貉腹泻病发病率近年来呈逐年上升趋势，且引起仔貉发病病因复杂，饲喂不合理、环境消毒不到位或更换饲料等应激刺激可直接导致仔貉发病[2]，多种病毒病或寄生虫感染通常易继发大肠杆菌感染，同时存在多种病原菌混合感染的可能，极大地增加了防控难度[16,17]，因此，广大养殖户应高度重视养殖场的卫生防控工作，并制定科学合理的免疫程序和饲养计划。

综上所述，本研究通过细菌分离鉴定、药敏试验、生化鉴定及毒力基因检测等对分离自腹泻仔貉中的大肠杆菌进行了系统研究，可为临床上貉源大肠杆菌病的防控奠定理论基础。