十堰市野生美味牛肝菌鉴定与菌丝生长最适培养基的筛选

常堃，蔡婧，李为民，王锋尖，李军，张九玲，肖艳，李世华，刘杰，周向宇，田继成

（1.十堰市农业科学院，湖北 十堰 442000；2.汉江师范学院生物化学与环境工程系，湖北 十堰 442000）

据统计，世界上可食用的大型真菌种类约2500种，其中最昂贵也最受欢迎的大多属于菌根菌[1]，美味牛肝菌就是其中之一。美味牛肝菌（Boletus edulis Bull.ex Fr.）属于担子菌亚门（Basidiomycotina）层菌纲（Hymenomycetes）伞菌目（Agaricales）牛肝菌科（Boletaceae）牛肝菌属（Boletus Fr.）[2]。美味牛肝菌又名大脚菇、网纹牛肝菌等[3]，因其菌肉肥厚，柄粗壮，食味香甜可口，营养丰富，是餐桌上深受欢迎的美味菌菜。菌根食用菌在栽培过程中，菌根合成和菌根苗的培养是菌根菌栽培成功的基础[4]，但是菌根合成的高成本也是限制其发展的主要因素。十堰市生长的牛肝菌以郧阳区美味牛肝菌最有名气，丰富的野生牛肝菌资源为当地百姓带来了较高的经济效益。近年来，由于过度采挖，野生美味牛肝菌资源正在不断减少，为此本文对郧阳区牛肝菌资源进行采集鉴定，并分离菌丝和筛选最适培养基，为美味牛肝菌的菌种制作和仿野生栽培做好基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

美味牛肝菌子实体于2018年9 月采自郧阳区白桑关镇栎树林中，由汉江师范学院王峰尖教授鉴定，对组织分离菌丝和子实体进行ITS 序列分析方法鉴定，分离所得菌丝低温保存备用[5]。

1.2 采集方式

野生美味牛肝菌生长处上方往往会有很多飞虫围绕盘旋，可借助此特性寻找野生美味牛肝菌。将采集的野生牛肝菌用无菌吸水纸将子实体包裹，分别放入平底纸盒中，尽快运回实验室进行处理。

1.3 不同部位组织分离对菌丝生长的影响

先将美味牛肝菌子实体外表用无菌水冲洗干净，用75% 的酒精进行表面消毒后，用无菌镊子掰开，再分别挑取菌柄、菌盖以及菌柄菌盖交界处直径5 mm左右的组织接入PDA 培养基中心，25℃恒温暗培养，每个部位分离15个重复，计算分离成活率（分离成功数/总分离数），并测量20d后菌落直径（每个处理随机取10个）。

1.4 基础培养基筛选

按照1.2 方法对菌柄进行组织分离，并接入以下培养基：①改良MMN[6]②母种培养基[7]③滨田培养基[8]④1/2MS培养基[9]⑤Ohta琼脂培养基[10]⑥PDA。每个培养基设10个重复，25 ℃恒温暗培养。观察菌丝生长的形态变化，培养到20 d 时测量菌落直径。

1.5 不同培养基的配制

浸提液制作方法：将选取的腐殖落叶、根系和土壤等阴干，取50g 放于1000mL 蒸馏水中文火煮沸30min后过滤[12]，得到浸提液。以亲体液配置各培养基再用蒸馏水定容至1 L，获得所需培养基。

根据基础培养基筛选结果，以基础培养基为对照，并在基础培养基中分别加入5%牛肝菌生长处腐殖落叶浸提液、5%牛肝菌生长处土壤中栓皮栎根浸提液、5%牛肝菌子实体浸提液及5%牛肝菌生长处土壤浸提液，并在以上培养基中分别设置无VB1和有VB1（浓度为0.001%）[11]两个处理。每个培养基设10 次重复，25℃恒温暗培养，观察菌丝生长的形态变化，培养到20d时测量菌落直径。

1.6 ITS测序分析

利用ITS1 (TCCGTAGGTGAACCTGC) 和ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）通用引物对美味牛肝菌子实体及纯化菌丝进行PCR 扩增鉴定[13]。

2 结果与分析

2.1 不同部位组织分离对菌丝生长的影响

由表1 可知，对美味牛肝菌不同部位进行组织分离，菌丝长势各有不同。在试验范围内对美味牛肝菌菌柄进行组织分离所得菌落直径最大。除菌盖处分离成活率较低，其余部位分离成活率均为100%；牛肝菌菌盖含水量较高，且菌肉较菌柄处薄，因此增加了污染的概率，导致成活率较低。

表1 不同部位组织分离对菌丝生长的影响Table 1 Effect of tissue separation on mycelial growth

2.2 基础培养基对菌丝生长的影响

基础培养基对美味牛肝菌菌丝生长的影响，见表2。在试验范围内，培养基为1/2MS 培养基时菌丝生长良好，菌落直径最大。

表2 基础培养基对菌丝生长的影响Table 2 Effect of basis culture medium on mycelial growth

2.3 不同培养基对菌丝生长的影响

不同培养基对美味牛肝菌菌丝生长的影响，见表3。在试验范围内，只有1/2MS+腐殖落叶+VB1培养基所得菌落直径略大于对照1/2MS 培养基，试验范围内VB1的添加无明显增强美味牛肝菌菌丝生长的作用。

图1 菌丝生长情况Fig.1 Mycelial growth states of Boletus edulis

表3 不同培养基对菌丝生长的影响Table 3 Effect of culture medium on mycelial growth

2.4 鉴定结果

美味牛肝菌子实体ITS 序列长度为739个碱基，与GenBank 中的序列（登录号GQ984158.1）同源性是99.32%；美味牛肝菌分离菌丝序列长度为737个碱基，与GenBank 中的序列（登录号GQ984158.1）同源性是99.72%，并与美味牛肝菌子实体的序列同源性为99.56%。结合形态学初步鉴定结果，所测菌株均为美味牛肝菌，与汉江师范学院王峰尖根据子实体特征及显微结构鉴定的结果一致[14]。

3 讨论

美味牛肝菌的菌根体外合成早已成功[15]，但是菌根合成到进行商业化出菇，目前来看并不现实，因此根据本地野生美味牛肝菌生长区的菌群特点，制作美味牛肝菌菌种进行仿野生栽培，不但可以对本地牛肝菌资源以及林木资源进行保护，同时投入相较菌根合成要低很多。

美味牛肝菌各部位组织分离成活率均很高，试验范围内菌柄分离所得菌落直径最优。美味牛肝菌菌丝分离培养基的研究很多，但是效果均不明显，试验范围内以1/2MS培养基可获得较大菌落，且明显优于其他培养基，而以1/2MS 培养基为基础培养基加入各种浸提液的培养基，所得菌落均无明显优势。下一步将利用1/2MS 培养基为基础研究其他培养基配方及液体菌种配方，以期获得适合美味牛肝菌生长的培养基配方，从而为美味牛肝菌的菌种制作及仿野生栽培打下基础。