基于UPLC-QQQ-MS 多指标统计分析研究不同生境人参中皂苷分布

张娜，黄鑫※，郭云龙，越皓，刘淑莹,2※

（1.长春中医药大学吉林省人参科学研究院，吉林 长春 130117；2.中国科学院长春应用化学研究所，吉林 长春 130022）

人参（Panax ginseng C.A.Meyer）为五加科人参属多年生草本植物，是我国传统的名贵中药，享有“百草之王”美誉[1]。人参皂苷是人参属植物中重要的活性成分，具有多种生理学活性, 主要包括兴奋神经中枢、改善学习记忆、增强机体免疫力、预防和治疗心血管疾病、抗疲劳、抗肿瘤、抗老年痴呆、对脑缺血的保护以及促进肝细胞增殖等[2-5]，皂苷的含量常被认为是评价人参内在质量的一重要指标[6,7]。据国内外最新研究表明，人参皂苷的含量因生长环境、部位、采收时间和加工贮存条件等不同而存在显著的差异[8-10]。

人参皂苷分布在植物的各个部位，不仅存在于地下部分的根，在地上部分的茎、叶、花和果中同样亦存在大量皂苷，且植株的不同部位皂苷种类和含量差异较大[11]。目前，国内外学者对人参的研究多集中在不同产地、不同部位人参皂苷含量的差异[12-15]，检测方法以高效液相色谱法最为普遍[16,17]，然而该方法存在着分析时间长、分离效率低等缺点。本研究采用UPLCQQQ-MS技术同时测定整株人参中20种主要皂苷成分含量，并对皂苷含量变化进行多变量统计分析，对不同生长环境（林地和平地）整株人参地上部位的茎叶及地下部位的根中皂苷分布进行全面系统对比，为人参内在质量的评价和控制提供依据，同时为不同生态环境下生长的人参的不同药用部位的药效研究提供参考。

1 仪器与试剂

1.1 药品与试剂

三七皂苷R1（批号：G22D9Y77958）、三七皂苷R2（批号：P13O9S72404）、人参皂苷Rf（批号：P25D8F51531）、Rc（批号：M12M9S61061）、Rb2（批号：P25D8F51140）、Re（批号：B10M8S35243）、Rg1（批号：Z13O8L45576）、Rd（批号：Z13N8X48155）、Ro（批号：C18S8G43979）、Rg3（批号：Z15D8X50607）、Rg2（批号：M23N9S75654）、F3（批号：Z13A9Y71342）、Rk1（批号：B27J8S39859）、F1（批号：Z27J9X64348）、Rh2（批号：Z12M9X61003）、Rb3（批号：Y05A8Y41182）、Rb1（批号：Z20S9X70603）、Rh1（批号：R26N9F75983）、CK（批号：Y20N9Z75484）、F2（批号：Z10A9X58128）（纯度≥98%，上海源叶生物科技有限公司）；甲醇、甲酸、乙腈（色谱纯，Fisher 公司）；实验用水为超纯水。

1.2 实验样品

不同生境整株人参鲜品（4年生，品种为大马牙）于9 月底采自吉林省靖宇县白山林村中药人参种植基地，分别为林地种植人参（10 批次）和平地栽培人参（10 批次），经长春中医药大学王淑敏教授鉴定为五加科人参属人参（Panax ginseng C.A.Meyer）根及茎叶。将整株人参的根和茎叶洗净，于阴凉通风处自然晾晒至干，按生长环境和部位不同分为平地人参根、平地人参茎叶、林地人参根及林地人参茎叶作为实验样品。

1.3 仪器

超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪（TSQEndura，美国Thermo 公司）；KQ-500DA 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；DHG-9246A电热恒温鼓风干燥器（上海精宏实验设备有限公司）；XS-204 电子分析天平（十万分之一，梅特勒-托利多仪器有限公司）；HH-8 数显恒温水浴锅（常州智博瑞仪器制造有限公司）；Milli-Q 超纯水制备仪（美国Merck Millipore 公司）。

2 方法

2.1 对照品溶液的制备

2.2 供试品溶液的制备

分别取干燥的人参根和茎叶样品，粉碎，过60 目筛，取样品粉末1.0 g，精密称定，置100 mL 锥形瓶中，加入70% 的甲醇20 mL，室温下超声提取2 次，每次1h，合并提取液，蒸干，用70%甲醇溶解，定容至10mL。过0.22m 微孔滤膜，待测。

2.3 色谱条件

Thermo Scientific Syncronis C18 色谱柱（100 mm2.1 mm，1.7m）；流动相：0.1%甲酸水（B）-乙腈（C）；梯度洗脱：0～5 min，25%～30%C；5～8 min，30%～32%C；8～9 min，32%～36%C；9～16 min，36%～37%C；16～18 min，37%～70% C；18～23 min，0%～80% C；23～28 min，80%～95% C；28～30 min，95%～25% C；30～40 min，25%～25%C。流速：0.2 mL · min1；柱温：35℃；进样量：5L。

2.4 质谱条件

采用TSQ Endura 超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪，电喷雾离子源（ESI）全扫描检测，利用负离子模式；喷雾电压：2500 V；鞘气流速：38 arb；辅助气流速：11 arb；吹扫气流速：1 arb；毛细管温度：329℃；质量扫描范围：m/z 150～2000。

3 结果

3.1 UPLC-QQQ-MS分析方法优化评价

考察了不同流动相组成和梯度洗脱程序下皂苷类成分的分离效果，最终结果表明，以0.1%甲酸水-乙腈为流动相，“2.3”项下梯度洗脱程序进行测定，分离效果最好。乙腈作为流动相时洗脱能力强，分离效果明显较甲醇好，且峰形较好，水相中加入甲酸可增强样品稳定性，改善峰形，减少拖尾。在负离子模式下，以皂苷类成分的稳定性、离子强度为依据，自动优化质谱参数。20种人参皂苷对照品分为3 组分别测定，A组包含Rg1、Rf、Rb1、Rc、Ro、Rb2、Rd 和CK；B 组包含Re、F3、Rg2、Rh1、F1 和Rh2；C 组包含NotoR1、NotoR2、Rb3、F2、Rg3和Rk1；3 组对照品及样品总离子流图如图1 所示。

图1 A、B、C：3 组对照品总离子流图 D：人参根总离子流图 E：人参茎叶总离子流图Fig.1 Total ion chromatography of 20 ginsenosides references (A, B, C), ginseng root (D) and ginseng stem and leaf (E)

精密吸取“2.1”项下对照品溶液适量混合后用70%甲醇稀释为混合对照品溶液，进一步逐级稀释，得一系列标准溶液，以“2.3”和“2.4”项下条件进行测定，以皂苷对照品浓度为横坐标，总离子流图中皂苷对照品提取离子的峰面积为纵坐标，进行线性回归，得回归方程、线性关系及线性范围，如表1 所示。精密吸取混合对照品溶液5L，重复进样5 次，计算各皂苷对照品峰面积的RSD，见表2，结果表明仪器精密度良好。分别精密吸取同一供试品溶液（林地人参根第1 批次样品）5L，分别于0、8、16、24、32、48 h 进样，测定峰面积，计算RSD 值均小于5%，见表2，因此样品在48 h内稳定性良好。取同一供试品5 份，按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.3”和“2.4”项下方法测定，计算各皂苷峰面积的RSD，见表2，结果表明该方法重复性良好。精密称取6 份已知含量的同一供试品1.0 g，分别精密加“2.1”项下对照溶液0.6、0.8、1.0 mL，加入70%甲醇定容，按照“2.3”和“2.4”项下方法测定，20种人参皂苷的平均回收率结果如表2 所示，方法的准确度满足分析要求。

表1 20种人参皂苷的回归方程及相关系数Table 1 Regression equation and correlation coefficient of 20 ginsenosides

表 220种人参皂苷的方法学参数Table 2 Methodological parameters of 20 ginsenosides

3.2 不同生境人参根及茎叶中20种皂苷含量测定

人参皂苷按苷元结构可分为原人参二醇型（PPD，如Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd 等）、原人参三醇型（PPT，如Re、Rg1、Rf、Rg2、Rh1 等）和齐墩果酸型（OLE，如Ro）3 类[18,19]，其中PPD 型和PPT 型人参皂苷是主要活性成分[20]。通过对人参皂苷进行含量测定，可以为其活性物质的筛选及其临床应用提供化学物质基础。10 批样品的供试品溶液经UPLC-QQQ-MS分析，按优化条件积分峰面积，根据相应的回归方程计算20种皂苷的含量，将10 批样品测定结果取均值，见表3。

表3 不同生境下人参根及茎叶单体皂苷含量（n=10，表中数据表示为x± ）Table 3 Contents of ginsenosides in roots, stems and leaves of Panax ginseng in different habitats.（n=10）

续表3

图2 不同生境人参根及茎叶皂苷含量箱型图Fig.2 Box plot of ginsenoside content in roots, stems and leaves of Panax ginseng in different habitats.

通过对人参根及茎叶中人参皂苷含量的检测发现，根和茎叶中人参皂苷组成和含量差异较大。10种PPD 型皂苷中Rb1、Rb2、Rb3 和Rg3 在人参根中含量较高，Rd、F2 和Rk1 含量在茎叶中较高，CK 和Rh2 在根和茎叶中均未检测到。9种PPT 型皂苷中Noto R1、Rf 及Rh1在人参根中含量高，Re、Noto R2、F3及F1含量在茎叶中较高，OLE 型皂苷Ro 在根中含量较高。而PPD 型皂苷中的Rc 和PPT 型皂苷中的Rg2 和Rg1 在根和茎叶中的含量相差较小。因此，为提高人参根及茎叶合理的开发和利用，可将人参茎叶作为Rd、F2、Rk1、Re、F3、Noto R2 及F1 的来源。将平地和林地样品结果对比发现，PPD 型皂苷中Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd 及Rg3在平地人参根及茎叶中含量较林地人参根及茎叶稍高，但相差不大，而F2 和Rk1 含量在林地人参茎叶中较高，在林地人参根和平地人参根中含量相同，CK 和Rh2 在平地和林地人参根及茎叶中均未检测到。检测的9种PPT 型皂苷和OLE 型皂苷Ro 均在平地人参样品中含量较高。

采用SPSS 软件对不同生境的人参根和茎叶皂苷含量进行统计分析，研究人参皂苷在不同生长环境和不同部位的分布情况。结果以箱型图形式呈现，如图2所示，可直观地反映出数据分布的基本特征，显示其分散情况。根据4个箱型图中皂苷含量的分布可直接确定每个皂苷的平均含量，进而对比分析PPD 型皂苷总含量、PPT 型皂苷总含量以及所有皂苷总含量。结果表明，平地人参根及茎叶中所含PPD 型皂苷总量、PPT型皂苷总量以及所有皂苷总量均高于林地人参，PPT型皂苷总含量在人参茎叶中高于人参根中。通过箱型图可看出，所测得的数据中极少存在异常值，表明所测得的结果准确且皂苷质量稳定。

4 讨论与结论

本文采用UPLC-QQQ-MS 技术同时测定整株人参中20种皂苷成分含量，实现了快速检测多种皂苷成分的需求，分辨率高，分析速度快，定性、定量更加准确。

人参的质量评价主要根据所含皂苷的种类及含量，目前，国内外学者对人参根的研究和利用较为广泛。本实验研究表明人参茎叶中也存在大量人参皂苷，尤其是Rg3 和Rk1 等稀有人参皂苷，为皂苷的获取提供了新的途径。所检测的20种皂苷中大部分皂苷在平地栽培环境下的人参根及茎叶中含量高于林地栽培人参，主要原因可能是林地人参在较短年限内因土质、虫害等因素的影响，生长状态较平地人参差。

另外，本文结合了多元统计分析方法对结果进行综合评价，使结果更为直观，更具说服力，为不同生境人参不同药用部位的药效研究提供思路，为人参的合理开发和利用鉴定基础，也为人参内在质量的评价和控制提供参考。