miR-26a 调节TFAP2C 表达对卵巢癌细胞的影响

姚祺 何嘏娜

研究发现，miR-26a（微小RNA-26a）于乳腺癌、肝癌、胃癌以及鼻咽癌组织和细胞中的表达下降，同时对肿瘤细胞增殖有抑制作用[1-3]。相关文献表示卵巢癌患者血清及卵巢癌组织中miR-26a 表达下调，卵巢患者癌组织中TFAP2C（转录因子活化蛋白2C）表达水平越高则患者预后越差，其和患者临床分期为正相关，处于进展期的卵巢癌患者其TFAP2C 表达阳性率明显比早期患者高[4-5]。有文献表示调控miR-26a 的靶基因之一就是TFAP2C[6]。为进一步提高卵巢癌的治疗效果，本文就miR-26a 调节TFAP2C 表达而抑制卵巢癌细胞的增殖效果进行探讨分析。

1 资料和方法

1.1 一般资料

所选择的病例对象均为卵巢癌患者，共有60 例，收集时间为2018 年11 月—2019 年12 月，患者年龄38 ～68 岁，平均年龄为（52.31±2.09）岁。所有患者均经临床症状、体征以及实验室检查确诊是卵巢癌，本研究获得医院伦理委员会批准和患者及其家属的知情同意。

1.2 研究方法

所需材料有miR-26a 模拟物、CAOV3（Caov3 Cell Line）（卵巢癌细胞株）、TFAP2C 抗体、RPMI1640 培养液、胎牛血清、转染试剂、MTS 细胞生长增殖/毒性检测检测试剂。取适量组织，以RNA 提取试剂体完成总RNA 的提取，同时进行逆转录合成cDNA（互补脱氧核糖核酸），其中PCR 扩增反应是20 μL 体系，包含有TaqDNA polymerase 0.2 μL，MiR-PCR primers 0.4 μL，2×SYBRMix 10 μL，灭菌蒸馏水以及miRNA RTproduct 2.0 μL。本次研究采用的循环体系共35 个，具体如下：95℃×3 min；95℃×12 s，72℃×30 s，62℃×35 s。将U6snRNA 作为内参，以2-△△CT 法来测定分析miR-26a 相对表达量。人卵巢癌CAOV3 细胞含有10%胎牛血清RPMI1640 培养液，放置在细胞培养箱中进行培养，培养环境：37℃，二氧化碳体积分数5%。细胞为单层贴壁生长，当细胞融合度达到80%～90%的时候实施常规传代。TFAP2C mRNA 的检测方式同上，以2-△△CT 法来检测TFAP2C mRNA 相对表达量。把miR-26a 模拟物或者TFAP2C siRNA 质粒转染至卵巢癌CAOV3 细胞，在48 h 以后进行细胞总蛋白的提取工作，以BCA 法检测蛋白浓度。每组均取相同数量的样本，实施SDS-PAGE 凝胶电泳，接着把蛋白转移到PVDF 膜上，以5%BSA 进行封闭，而后添加TFAP2C 或者GAPDH 抗体，在4℃条件下过夜。经TBST 洗膜半小时，添加二抗室温进行1 h孵育；以TBST 洗膜半小时，添加ECL 发光剂，通过X 片曝光、显影以及定影工作。提取经转染的卵巢癌CAOV3 细胞，完成消化以后接种细胞在96 孔板中，每一个孔有5 000 个细胞，各组设有6 个复孔，将其放置在温度为37℃、5%CO2培养箱中进行培养。把RPMI-1640 培养基添加到没有接种细胞的孔中，将其当做凋零孔。在接种72 h 以后，在各孔中加入20 μL MTS 检测试剂，在温度为37℃下进行孵育，时间2 h，借助于酶标仪检测492 nm 波长吸光度值，共进行三次实验。

1.3 观察指标

观察患者miR-26a 表达量、 TFAP2C 表达水平。

1.4 统计学方法

采用SPSS 18.0 软件。计量资料用（±s）表示。计数资料用（n，%）表示。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

通过qRT-PCR 检测发现，卵巢癌患者miR-26a 表达量为（0.68±0.15）[ 正常人表达量范围（5.35±0.44）]，TFAP2C 表达量为（3.87±1.02）。通过Western blot 检测发现，和阴性对照组相比较，转染miR-26a 组、TFAP2C siRNA 组 TFAP2C 表达水平明显要低，可见miR-26a 可下调卵巢癌CAOV3 细胞系中TFAP2C 的表达（图1）。分别 把miR-26a 模拟物（miR-26a -mimics）、miR-26acontrol 组（阴性对照组）和TFAP2C siRNA（ siRNA 组）、siRNA-control（阳性对照组）及转入卵巢癌细胞24 h、48 h以及72 h 以后，经MTT 法检测miR-26a 对于细胞增殖的影响。经过研究发现，转染TFAP2C siRNA 组（0.53±0.12）、miR-26a 模拟物组（0.51±0.02）癌细胞增殖率速度减慢，和miR-26a-control 组（1.01±0.23）比较差异有统计学意义（P＜0.05）。可见高表达miR-26a 经下调TFAP2C 的表达，抑制卵巢癌细胞的增殖（如图2）。

图1 Western blot 检测miR-26a 对TFAP2C 的影响

图2 miR-26a 和TFAP2csiRNA 对CA0V3 细胞增殖的抑制

3 讨论

调查研究表明，在女性生殖系统肿瘤的发病率中卵巢癌占据前列，早期患者生存率较高，然而实践发现大部分患者到院就诊时已处于晚期，同时多数患者在实施化疗时很容易产生耐药性，因此急需寻找更为有效的药物进行治疗[7-8]。研究表明，miR-26a 于肝癌中的表达水平高低和患者生存时间、对干扰素治疗的敏感程度密切相关；miR-26a 鼻咽癌中表达水平降低，并且可经靶基因组蛋白甲基化转移酶对癌细胞生长以及增殖产生抑制作用[9]。另外miR-26a 于乳腺癌组织以及乳腺癌细胞中的表达显著下调，可明显抑制乳腺癌细胞增殖，且过表达miR-26a 可诱导细胞凋亡[10]。本文笔者就miR-26a 调节TFAP2C 表达而抑制卵巢癌细胞的增殖效果进行分析，研究发现，卵巢癌患者miR-26a 于卵巢癌细胞中的表达下调显著。有文献报道，TFAP2C 为miR-26a 调节的靶基因，本次研究也证实该理论。TFAP2 作为重要转录因子之一，经和其靶基因启动子上作用元件结合对靶基因特异性表达进行控制，以此对细胞迁移、凋亡、分化以及增殖等进行调控[11]。有报道表示TFAP2C 和肿瘤基因不稳定、肿瘤细胞增殖、侵袭、抗凋亡以及药物抵抗存在着密切的关系[12-13]。本次研究还发现卵巢癌细胞中过表达miR-26a或者干扰TFAP2 以后可显著抑制癌细胞增殖活力，由此可见，miR-26a 可能经下调TFAP2C 表达量对卵巢癌细胞CAOV3 增殖产生抑制作用。

综上，卵巢癌细胞中miR-26a 表达量下调，可经调控TFAP2C 的表达抑制细胞增殖，临床中可加强miR-26a 观察和调控。