养阴清肺汤对肺炎支原体肺炎作用机制的网络药理学分析

汤玉梅，任园园，吴振起

1.辽宁中医药大学研究生学院，辽宁 沈阳 110847；2.辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳 110032

肺炎支原体肺炎(Mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP)是一种以发热、剧烈干咳以及胃肠道症状等为主要临床表现的呼吸系统疾病[1]。MPP多归属于中医的“咳嗽”、“肺炎喘嗽”等范畴，疾病前期外感风邪,外邪由口鼻或皮毛而入，侵犯肺卫，出现发热、咳嗽、鼻煽、痰鸣等证候，发为肺炎喘嗽；疾病后期多为气阴两虚证[2-3]。MPP 的临床治疗应以清热化痰、止咳平喘、益气养阴为主。养阴清肺汤出自《重楼玉钥》，盛丽先教授取养阴清肺汤滋阴凉润之功，用于肺炎支原体感染后阴虚内热咳嗽[4]。养阴清肺汤成分十分复杂，其治疗MPP 的作用机制尚未明确。因此，本研究拟利用网络药理学方法，探究养阴清肺汤主要药效物质基础、核心靶点及信号通路之间的关系，为进一步阐述养阴清肺汤治疗MPP的药理机制提供参考。

1 资料与方法

1.1 养阴清肺汤活性成分及靶点 将养阴清肺汤全方生地黄、麦冬、牡丹皮、白芍、薄荷、玄参、浙贝母、甘草分别输入TCMSP、TCMID、Swiss Target Prediction数据库检索养阴清肺汤活性成分作用靶点，根据筛选阈值口服利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和类药性(drug-likeness，DL)≥0.18 进行筛选，并利用UniProt数据库(https：//www.uniprot.org/)将靶蛋白转换成对应的靶基因。在GeneCards (https：//www.genecards.org/)数据库以“Mycoplasma pneumoniae pneumonia”为检索词，搜索肺炎支原体肺炎靶基因，将肺炎支原体靶基因与养阴清肺汤活性成分靶基因输入Venny2.1 软件(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)，取得两者交集靶基因作为养阴清肺汤治疗肺炎支原体靶基因，将活性成分及其靶点导入Cytoscape3.7.2 软件，构建活性成分-抗肺炎支原体靶点网络图。

1.2 养阴清肺汤活性成分抗MPP 靶点相互作用研究 将筛选得到的活性成分-抗肺炎支原体靶点导入 STRING 平台(https：//string-db.org/cgi/input.pl)构建靶蛋白互作网络(protein-protein interaction，PPI)，设置蛋白种类为“Homo sapiens”，低相互作用阈值为“medium confidence”，其他参数保持默认值。将PPI网络导入Cytoscape3.7.2软件，利用“Network Analysis”功能计算蛋白节点的度值(Degree)和介数(Betweenness)2 个重要网络拓扑参数，选取Degree在平均值之上的靶蛋白作为养阴清肺汤治疗肺炎支原体的关键靶标。

1.3 养阴清肺汤活性成分抗MPP 靶点基因本体(GO)功能富集京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析 将养阴清肺汤抗MPP 关键靶点输入Omicshare (https://www.omicshare.com/tools/)云平台进行GO功能富集分析；利用DAVID数据库进行京都基因与基因组百科全书(KEGG)信号通路分析，物种与背景设置均为“Homo sapiens”(智人)进行操作(https：//david.ncifcrf.gov/)对关键靶点进行KEGG 通路富集分析。依据P＜0.001筛选养阴清肺汤抗MPP靶点富集的生物功能及信号通路，以阐明养阴清肺汤的活性成分对肺炎支原体肺炎靶点具有一定的生物功能，以及在相关信号通路中的起调控作用。

2 结果

图1 活性成分-MPP靶点韦恩图

图2 活性成分-MPP靶点网络

编号YY1 YY2 YY3 YY4 YY5 YY6成分10-de-oxyeucommiol 6-O-sec-hydroxyaeginetoyl ajugol adenosine coniferin diincarvilone A ferulic acid methyl ester YY7 YY8 YY9 YY10 YY11 YY12 YY13 YY14 YY15 YY16 YY17 YY18靶点PTGER3、EPHX1 MMP9、MMP8、MAPK14 GAPDH、EGFR、PDCD4、MAPK1、HSPA1A TYMP、MMP8 MAPK14、MAPK1、TNF、PARP1、PTGS2、NR3C1、MAPK10、TK1、RET、TKT MMP9、EGFR、PARP1、PTGS2、RET、TLR4、CYP1A2、STAT3、IDO1、ALPL、ELANE、CYP3A4、CASP3、CYP1A1、BRAF、TLR9、F3 MAPK14、RET、NR3C1、ELANE、PTPN6、HMOX1、FABP5、EPHX1、PTGS2、STAT3 STAT3、VEGFA、CYP2D6、IL2 GSTM1、JUN、NOS2、ABCB1、IL1B、PDCD4、PTGS2 VEGFA NOS2、G6PD、TOP1、ATP12A、PTGER3、TNF、NR3C1、PTPN6、FABP5 PTGER3、TNF、NR3C1、PTPN6、FABP5、NOS2、G6PD、TOP1、ATP12A TYMP MMP9、EGFR、MAPK1、PARP1、TLR4、ALPL PTGS2 PTGS2、CASP3、JUN、TGFB1 ALPL、NOS2 ALPL YY19MAPK1、TNF、PTGS2、RET、BRAF、RXRA YY20TNF、PARP1、RET、ALPL、BRAF、F3、MMP8 YY21 YY22 YY23 YY24 YY25 YY26 YY27 YY28 YY29 YY30 YY31 YY32 YY33 YY34 YY35 YY36 YY37 YY38 YY39 YY40 guanosine rehmaglutin a rehmaglutin c rehmaglutin d rehmaionoside c rehmapicrogenin salidroside trans-p-hydroxy cinnamic acid methyl ester sugiol beta-sitosterol 2'-hydroxymethylophiopogonone a 5,7,2'-trihydroxy-6-methyl-3-(3',4'-methylene-dioxybenzyl)chromone 5,7-dihydroxy-6,8-dime thyl-3-(4'-hydroxy-3'-methoxybenzyl)chroman-4-one 5-hydroxy-7,8-dimethoxy-6-methyl-3-(3',4'-dihydroxybenzyl)chroman-4-one 6-aldehydo-isoophipogonone a 6-aldehydo-isoophipogonone b diosgenin isoophiopogonone a jasmololone methy-lophiopogonone b methyl beta-orcinol caroxylate methyl ophiopogonanone a methyl ophiopogonanone b n-(trans-p-coumaroyl)tyramine n-trans-feruloyltyramine n-[β-hydroxy-β-(4-hydroxyphenyl)]ethyl-4-hydroxy cinnamide ophiopogonanone b ophiopogonanone c ophiopogonanone e ophiopogonanone f ophiopogonone a ophiopogonone b ophiopogonone c orchinol YY41 YY42 YY43 stigmasterol-beta-d-glucoside paeoniflorin kaempferol YY44 YY45(+)-catechin quercetin ALPL、NOS2 ALPL、NOS2、ABCB1、CYP2C9 MAPK14、CYP3A4、IL2、CYP2C9 ALPL、NOS2 MMP9、MAPK14、EGFR、MAPK1、NR3C1、HMOX1、NOS2、IL6、MAP2K1 ALPL、NOS2、ABCB1 MMP9、MMP8 MMP8、MAPK1、PARP1、RET、BRAF、F3 PTGS2、BRAF、F3、RXRA、STAT6 MMP9、MMP8、MAPK14、EGFR、ELANE MMP8、EGFR、TNF、PTGS2、BRAF、TOP1、MAP2K1 MMP9、MMP8、EGFR、MAPK1、TYMP、ALPL、BRAF、VEGFA、TOP1、MAP2K1、HIF1A、TLR9 PTGS2、BRAF、JUN、ABCB1、RXRA PTGS2、ALPL、NOS2 MMP8、TNF、PARP1、BRAF MMP8、TNF、MAPK1、PARP1、BRAF ALPL ALPL、ABCB1、CYP2C9 ALPL、NOS2 MMP9、MAPK14、EGFR、PARP1、RET、STAT3、CYP3A4、BRAF、CYP2D6、IL2、CYP2C9、MAP2K1 STAT3、IL2 TNF、IL6、CD14、LBP TNF、PTGS2、CYP1A2、CYP3A4、CASP3、CYP1A1、HMOX1、GSTM1、JUN、NOS2、NOS3、ICAM1、SELE、GSTP1、SLPI PTGS2、RXRA PTGER3、MMP9、EGFR、MAPK1、TNF、PARP1、CYP1A2、CYP3A4、CASP3、CYP1A1、F3、HMOX1、VEGFA、IL2、GSTM1、JUN、NOS2、IL1B、TOP1、TGFB1、RXRA、IL6、HIF1A、NOS3、ICAM1、SELE、GSTP1、PLAU、IL10、TP53、ODC1、SOD1、MYC、CCL2、CXCL8、IFNG、PTEN、IL1A、CRP、CD40LG、PTGS2

续表1

续表1

2.1 养阴清肺汤活性成分抗MPP 靶点及其网状图 将TCMSP、Swiss Target Prediction 数据库检索得到的152 个活性成分对应768 个活性成分靶基因与GeneCards 数据库挖掘到的274 个肺炎支原体肺炎靶基因交集筛重，得到136个活性成分对应的74个抗肺炎支原体肺炎的靶基因，见图1。通过Cytoscape3.7.2软件建立养阴清肺汤136 个活性成分对应74 个靶标的关系网络，结果见表1、图2。从方剂-化合物-靶点网络的总体特征分析发现，136 个活性成分中既存在一个化合物作用于多个蛋白靶点，同时也存在多个化合物与同一个蛋白靶点作用的现象，表明了养阴清肺汤治MPP的多成分、多靶点的作用特点。连接靶标最多的5 个化合物分别是槲皮素、阿魏酸甲酯、木犀草素、山奈酚、鸟苷；与化合物成分连接最多的前10个靶标基因分别是PTGS2、NOS2、MAPK14、RXRA、TNF、EGFR、MAPK1、MMP9、PARP1、TOP1。活性成分-抗肺炎支原体肺炎靶点网络图共有211 个节点，682 条边，每个活性成分均能作用于多个抗肺炎支原体肺炎靶点，体现了养阴清肺汤的多成分、多靶点作用。

2.2 养阴清肺汤活性成分抗MPP靶点的PPI网络分析 PPI网络共74个节点，1 023条相互作用连线，平均degree27.65，平均betweenness为9.26×10-3，degree超过平均值的靶点共有35 个，主要包括IL6、TNF、PTGS2、IL10、IL1B、IL4、IL2、ICAM1、IFNG、CRP、NOS2、CD40LG、CXCL8、ELANE、STAT3、TLR4、CCL2、MAPK1、MAPK14、TGFB1、TLR9、FASLG、STAT6 免 疫 炎 症 因 子 ，VEGFA、HMOX1、NOS3、NR3C1、CASP3 心 血 管 靶 点 ，TP53、JUN、MYC、MMP9 癌基因及 EGFR、GAPDH 等，说明养阴清肺汤作用机制主要与其调节免疫炎症、心血管生理、抑癌基因、细胞周期及凋亡等密切相关。结果见图3、表2。

表2 关键靶点及其拓扑参数

2.3 养阴清肺汤抗MPP靶点的GO功能富集 根据P＜0.001，共获取442个GO条目，其中生物过程(biology process)占 408 个，分子功能(molecular function)占22个，细胞组成(cellular componet)占12个。其中生物过程涉及生物过程调节、免疫系统过程、刺激反应、代谢、细胞增殖、发育过程等；分子功能及细胞组成主要涉及催化活性、转录调节因子活性、分子传感器活性、抗氧化活性以及细胞器、细胞膜、突触等。说明养阴清肺汤可能通过调节免疫系统以及调控细胞增殖、凋亡、代谢等发挥抗MPP的作用，见图4。

2.4 养阴清肺汤抗MPP 靶点的KEGG 通路 对筛选出的核心靶点进行KEGG 通路富集分析，共获得 89 条富集通路，其中 P 值＜0.001 的前 30 条通路(图5)与养阴清肺汤抗MPP 密切相关的有TNF 信号通路、T 细胞受体信号通路、PI3K-Akt 信号通路、Jak-STAT 信号通路、Toll 样受体信号通路、MAPK 信号通路、NOD 样受体信号通路等。结果表明，养阴清肺汤抗MPP 主要通过对免疫通路与炎症通路的影响，进而改善MPP 的临床症状。

图4 养阴清肺汤抗MPP靶点的GO功能富集

图5 KEGG信号通路点状图

3 讨论

养阴清肺汤出自清代著名医家郑梅涧所撰《重楼玉钥》，由生地黄、麦冬、牡丹皮、白芍、薄荷、玄参、浙贝母、甘草八味药组成。药用生地甘苦而寒，既能滋肾水救肺燥，又能清热凉血解疫毒，故重为君药；麦冬养阴润肺清热，玄参清热解毒散结，两者共助生地养阴清热解毒，为臣药；白芍敛阴和营，丹皮凉血活血，贝母润肺化痰，薄荷辛凉宣散，共为佐药；生甘草清热解毒，调和诸药。多项研究表明，养阴清肺汤对MPP疗效确切。李炜[5]研究发现以养阴清肺汤联合孟鲁司特钠咀嚼片治疗MPP致慢性咳嗽有助于缓解患儿的症状体征和减轻炎症反应。付慧玲[6]研究发现养阴清肺汤联合阿奇霉素治疗儿童肺炎支原体肺炎疗效倍增。章红[7]研究表明养阴清肺汤联合阿奇霉素治疗肺炎支原体肺炎可提高治愈率，缩短病程，减少副作用的发生，具有良好的治疗作用。本研究通过网络药理学方法，相对全面地探究了养阴清肺汤治MPP可能的分子机制。

本研究基于网络药理学方法，明确了养阴清肺汤136种成分74个MPP靶点，并根据PPI网络分析筛出35个关键靶点，发现养阴清肺汤的关键靶点主要归属于免疫炎症、心血管生理、抑癌基因、细胞周期及凋亡相关蛋白等。MP可刺激单核巨噬细胞、淋巴细胞等诱导产生IL-1、IL-2、IL-3，IL-6，IL-8，IL-10，IL-12，IL-18 以及TNF-α等多种细胞因子，其中TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等可能与MPP发病机制有关。GO生物过程主要包括生物过程调节、免疫系统过程、刺激反应、代谢、细胞增殖、发育过程等。MPP发病机制虽不明，但这与目前提出的免疫损伤、呼吸道上皮吸附作用、MP细胞毒素学说[8]机制相吻合，说明养阴清肺汤主要通过调节机体免疫功能、代谢、细胞增殖等作用来治疗MPP。

本研究通过KEGG富集分析表明与养阴清肺汤治疗MPP相关通路主要涉及调节免疫功能、抑制炎症等通路。免疫损伤是MPP重要的发病机制学说之一，MP的免疫损伤机制包括：体液免疫损伤、细胞免疫损伤、炎症损伤、抗原免疫损伤和免疫抑制[9]。T细胞亚群相互协调作用的关键是维持T淋巴细胞亚群及Th1/Th2机体的免疫平衡，而肺支原体能直接刺激T、B淋巴细胞增殖，同时释放TNF-α、IFN-γ、IL-1等细胞因子，引起Th1/Th2/Treg 免疫细胞亚群失衡，加重机体的免疫损伤[10]，养阴清肺汤可能作用于T细胞受体调节MPP患者免疫功能。肿瘤坏死因子(TNF)，又称为TNF-α，它参与全身炎症反应，是组成急性期反应的细胞因子之一。TNF-α主要由Th1分泌，能增强T细胞、B细胞、NK细胞等的免疫活性[11]。Toll样受体(TLR)是参与非特异性免疫的一类重要蛋白质分子，也是连接非特异性免疫和特异性免疫的桥梁，研究表明MPP患儿的TLR4水平较高[12]，且TLR2信号通路在肺组织对抗MP感染而产生的天然应答中起关键作用[13]。NLRP3为NOD样受体家族成员，研究发现NLRP3炎症小体通路参与MPP发病过程，且与病情严重程度密切相关。PI3K-Akt信号通路是具有酶活性的细胞内信号转导通路，体内外实验研究证实PI3K-Akt信号通路在肺部炎症反应中发挥着重要的负向调控作用[14]。p38是MAPK信号通路的关键因子，p38MAPK被激活后影响转录因子的活性，从而调控炎症反应[15]，实验研究显示MP感染后大鼠肺组织的p38MAPK蛋白表达升高[16]。JAK-STAT信号通路是介导炎症介质过度表达的信号转导通路之一，实验表明肺部感染的发生机制与JAK2-STAT3信号转导通路的活化密切相关[17]。以上可知，养阴清肺汤调节MPP免疫反应可能作用于T细胞受体、TNF、Toll样受体、NOD样受体等信号通路，此外养阴清肺汤还可能通过PI3K-Akt、MAPK 以及 JAK2-STAT3 等信号通路发挥抗炎的作用。

综上所述，本研究利用网络药理学的方法获取养阴清肺汤抗MPP的相关靶点以及通路，发现其可能主要通过调节免疫系统与炎症系统来改善MPP 的临床症状，但有待通过进一步体内外实验加以验证。