一株兼具产IAA能力纤维素降解菌的筛选、鉴定及条件优化

吴婧 聂彩娥 朱媛媛 黄薇 马超 姜瑛 朱林 郜红建

（1. 农田生态保育与污染防控安徽省重点实验室，安徽农业大学资源与环境学院，合肥 230036；2. 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，北京 100081；3. 河南农业大学资源与环境学院，郑州 450002）

沿淮地区农作物秸秆产量丰富，但秸秆还田利用率却不高，这是因为自然状态下还田腐解缓慢，会影响耕作和作物生长［1］。砂姜黑土是沿淮地区的主要土壤，是典型的中低产土壤类型之一，土壤养分贫乏加之秸秆腐解缓慢不利于下茬作物的萌发和生长［2-3］。如何加速秸秆的腐解和养分释放已成为沿淮地区迫切需要解决的问题。

添加腐秆剂能够有效加速还田秸秆的降解，使其短时间内转化成有机肥、释放营养元素［4］。然而，由于砂姜黑土耕层土壤肥力低、理化性状差，外源微生物难以在其中存活和发挥功效，这造成功能菌来源非砂姜黑土中的腐秆剂在砂姜黑土上的应用效果较差［5-6］。研究表明，在目标地筛选的菌株对原有环境的适应性更强，不仅易于存活还可避免对原环境微生物种群的扰动，能够解决外源菌株应用效果不佳等问题。例如，Sun等［7］针对农业秸秆在寒冷地区难以降解的问题，从中国寒冷地区的土壤中筛选具有抗低温能力的纤维素降解细菌LKR-1提升农业秸秆的降解速率；Jha等［8］为解决土壤盐分制约植物生长的问题，从盐生植物的根中筛选出耐盐菌株提高受盐影响地区作物的产量；贺军军等［9］从甘蔗渣中分离出高效淀粉降解菌，其能够快速降解甘蔗渣缩短堆肥时间，促进甘蔗渣肥料化发展。鉴于砂姜黑土中也有大量参与秸秆降解的微生物，且其对砂姜黑土特殊的理化性状较为适应［10］。因此，通过从砂姜黑土中筛选秸秆降解菌来创制腐秆剂有望提高菌株存活差及其引起的促腐效率低等问题。

沿淮砂姜黑土区的耕作制多为茬口短暂的麦玉轮作，还田腐解不及时的小麦秸秆会导致土壤空隙，造成下茬的玉米种子无法与土壤充分接触，生长受到负面影响［11］。研究表明，植物促生菌可产生植物激素直接刺激幼苗生长［12］。例如，细菌分泌的吲哚-3- 乙酸（Indole-3-acetic acid，IAA）可参与植物的发育过程，促进植物生长［13］。因而，如果从砂姜黑土上筛选出的秸秆降解菌兼具植物促生功能，那么其应用前景将更为广阔。为了满足农业生产中面临的多方面需求，越来越多的研究人员尝试选育具备多重功能的菌株。例如，万兵兵等［14］针对烟区土壤中养分缺乏、烟草生长不佳的问题，从烟草根际中分离兼具解磷和解钾功能的根际促生菌提高土壤中磷、钾的含量，促进烟草生长；骆婷等［15］从森林土壤中筛选出同时降解纤维素、淀粉、蛋白质及油脂的多功能资源菌株，在提高农业耕地土壤肥力和改善农作物品质等方面作用显著。由上，秸秆还砂姜黑土田时配施具有产IAA能力的秸秆降解菌为核心的腐秆剂或可解决该区秸秆直接还田利用面临的两大难题。

本研究拟从连续多年进行秸秆还田的砂姜黑土试验田中筛选出兼具高产CMC酶（内切-β-1，4-葡聚糖酶）和IAA能力的菌株，通过秸秆腐解和玉米促生试验验证其实际促腐和促生效用，并探究其生长、产CMC酶和IAA的最佳培养条件，以期为适用于砂姜黑土区麦玉轮作制度的腐秆菌剂开发及应用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 土壤采自安徽省蒙城县内农业示范科技园区长期秸秆还田试验小区的砂姜黑土，有机质12.5 g/kg，全氮0.137 g/kg，碱解氮80.2 mg/kg，速效磷15.4 mg/kg，速效钾100.3 mg/kg。秸秆和玉米种子分别为安徽省蒙城县农业示范科技园区的小麦秸秆和市场上购买的“郑单958”。

1.1.2 培养基 LB培养基，无机盐培养基，液体发酵培养基，富集培养基和羧甲基纤维素培养基［16-17］。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分离、筛选 称取 10 g土壤样品接种于90 mL无菌水中，28℃，150 r/min摇床震荡30 min。取1 mL土壤悬液，加入9 mL无菌水，制成浓度为10%的原液，用LB琼脂平板进行连续稀释培养分离出细菌。在（30±2）℃温度下培养直至出现菌株，单个菌落被选取并在LB平板上划线进一步纯化。将分离、纯化获得的菌株分别接种在羧甲基纤维素钠选择培养基上，通过水解透明圈的大小定性分析其纤维素降解功能［16］。

1.2.2 CMC酶（endo-1，4-β-D-glucanase，内 切-β-1，4-葡聚糖酶）活测定 将菌种接种于以玉米秸秆粉为唯一碳源的液体培养基中37℃液体摇瓶培养60 h，把发酵液于4℃、5 000 r/min离心10 min，上清液即为粗酶液。参照DNS（3，5-二硝基水杨酸）法测定酶液中还原糖含量［18］。酶活性的一个单位（U）定义为在温度为50℃、pH值为4.8的条件下，1 mL酶溶液每分钟释放相当于1 μmol还原性糖的酶量。

1.2.3 IAA含量测定 将具有纤维素降解功能细菌接种于含有L-色氨酸（100 mg/L）的LB液体培养基，30℃，180 r/min培养1 d，然后10 000 r/min离心10 min，将2 mL上清液与等体积Salkowski比色液混合，室温遮光静置30 min，根据标准曲线在530 nm波长处的光谱吸光度测量来计算IAA含量［19］。

1.2.4 菌株的鉴定 形态鉴定和生理生化特性研究参考文献［20-21］。细菌基因的提取及16S rDNA扩增参照文献［22］，将获得的16S rDNA序列在GenBank数据库中做比对，Blast搜索同源序列，使用MEGA5.0软件，用Neighbour-Joining法构建系统发育树，结合形态学和生理生化特征确定菌株的名称。

1.2.5 菌株实际秸秆降解能力研究 称取粉碎后过20目筛的小麦秸秆粉5 g于250 mL三角瓶中，加水30 mL，加硝酸钠2 g，加浓度为1×108CFU/mL离心重悬到无菌水中的菌液10 mL，28℃、120 r/min条件下恒温振荡，培养15 d后将培养物离心（5 000 r/min 10 min）弃上清液，用蒸馏水反复清洗侧壁，80℃烘干至恒重，另设无菌水替代菌液，其他步骤一致，作为对照处理，每个处理3个重复，秸秆腐解率采用失重率法［16］。

1.2.6 菌株的实际玉米促生作用 取田间耕作层土壤，除去砾石及杂草枯枝后，混匀过5 mm孔径筛，每盘装土5 kg。设置两个处理，每个处理重复5次。对照处理（CK）：土壤中接种灭活细菌n3；接菌处理（n3）：土壤中接种细菌n3。用0.1%的HgCl2对玉米种子进行表面灭菌10 min后，用无菌蒸馏水冲洗5次。将细菌n3接种于LB培养基中，37℃ 150 r/min摇床培养48 h，然后将培养物离心（5 000 r/min 10 min），再重悬于无菌水中至密度为1×108CFU/mL，最后在土壤中接种。玉米种子每盆播种5粒，并将土壤含水量调至田间最大持水量的60%，49 d后对每种处理的5个重复样品取样，测量玉米的根长、表面积、根尖数、株高、SPAD值和植株鲜重等。

1.2.7 玉米生物学性状测定 玉米株高和 SPAD 值分别选用钢卷尺和 TYS-A 型叶绿素测定仪测定；地上部鲜种用百分之一天平进行测定［23］。玉米根系长度、直径、表面积用根系扫描仪（LA1600+ scanner，Canada）获取单个植物的根图像进行测定［19］。

1.2.8 菌株的最佳生长、产酶和产IAA条件研究

1.2.8.1 不同培养条件对菌株产CMC酶的影响 将菌种接种于以小麦秸秆粉为唯一碳源的液体培养基中37℃液体摇瓶培养，设置不同初始pH（4、5、6、7、8、9和10）、不同装液量（25、50、75、100和150 mL/250 mL）、不同氮源（硝酸钾、硫酸铵、硝酸铵、酵母粉、谷氨酸、尿素、蛋白胨），培养60 h后用分光光度计测定其OD520值计算菌株产CMC酶的含量。

1.2.8.2 不同培养条件对菌株生长和产IAA能力的影响 将含有100 mg/L L-色氨酸的50 mL LB液体培养基装于250 mL三角瓶中，按照体积分数1%的接种量接种菌株，30℃，180 r/min摇床培养。设置不同初始pH（4、5、6、7、8、9和10），装液量（25、50、75、100和150 mL/250 mL），不同氮源（硝酸钾、硫酸铵、硝酸铵、酵母粉、谷氨酸、尿素和蛋白胨），培养24 h后测定菌株生长情况（OD600）和产IAA能力（OD530），每个处理设3个重复。

2 结果

2.1 不同供试的菌株CMC和IAA生产能力比较

从长期秸秆还田砂姜黑土中筛选出8株纤维素降解细菌n1、n2、n3、n4、n5、n6、n7和n8（图1）。菌株n3产生的CMC酶活最高，可达20.60 U/mL 显著高于其他菌株；其次是n2，CMC酶活力为17.98 U/mL，其他菌株间CMC酶活力无明显差异（图1-A）。n3菌株产IAA能力也是最强的，浓度可达20.15 mg/L，显著高于其他菌株（P＜0.05），n2、n6、n7菌株均无IAA产生（图1-B）。因此我们选取菌株n3为具有降解纤维素和合成IAA的多功能菌株，并进行秸秆降解试验和盆栽试验验证其促腐和促生效果。

图1 不同菌株产CMC酶（A）和IAA能力（B）

2.2 供试菌株n3的形态、生理生化及遗传性状

对菌株的形态特征进行观察，发现n3菌株表面光滑，菌落较小，边缘整齐，不透明，略带黄色，不规则杆状排列（图2-A）；菌株呈稍弯曲或弧状的杆状（图2-B）。对n3菌株进行革兰氏染色、甲基红反应（M.R）和 V-P 试验、好氧性试验和接触酶试验后得到其生理生化结果。由表1可知，n3菌株是革兰氏阴性的好氧菌，其明胶液化、V-P 试验、甲基红反应（M.R）、柠檬酸盐利用、淀粉水解项目均呈现阴性反应，接触酶利用则呈现阳性反应。将n3菌株的16S rDNA序列与NCBI数据库Blast进行同源性比较，并采用MEGA 5.0构建系统发育树（图3）。根据图3，n3菌株与固氮螺菌（Azospirillum zeae）的同源性最高，亲缘关系最近。结合形态学分析和生理生化特征结果，n3菌株被鉴定为玉米固氮螺菌。

图2 菌株n3的菌落形态观察（A）和革兰氏染色（B）

表1 菌株n3的生理生化特征

图3 基于n3和相关菌株的16S rDNA序列采用邻接法建立的系统发育树

2.3 菌株n3的秸秆促腐和植物促生能力

液态摇瓶试验表明，接种n3处理的小麦秸秆降解率达到15.1%，较对照提高了54.71%（P＜0.01，表2）。与对照相比，玉米植株和根系性状在接菌后也有显著改善，根长、平均直径、SPAD值分别显著增加18.3%、22.0%和5.24%（P＜0.05，表2）。

表2 接种菌株n3对秸秆促腐和玉米生长的影响

2.4 菌株n3的最佳生长、产CMC酶和产IAA条件分析

n3生长状况在不同初始pH时差异显著（P＜0.05）；当pH为4.0和5.0时，菌株n3不生长，而当pH为6.0时，菌株生长量达到最大（图4-A）。当250 mL三角瓶装液量为25 mL时，菌株n3生长状况达到最优，随着装液量的增加，n3菌株的生长呈逐渐下降趋势（图4-B）。氮源促进菌体生长的顺序为：酵母粉＞蛋白胨＞谷氨酸＞尿素＞硫酸铵＞硝酸钾＞硝酸铵（P＜0.05，图4-C）。

随着pH增加，n3的CMC酶活呈先升后降的趋势，在pH值为5.0时，CMC酶活力最高，达到24.96 U/mL（图4-D）。n3的CMC酶活随装液量的增加呈先降后升的趋势，三角瓶装液量为25 mL（1/10）时，CMC酶活力最高，为15.33 U/mL（图4-E）。尽管不同氮源对n3产CMC酶能力的影响较对生长的小，但最佳氮源依然为酵母粉，此时CMC酶活达18.30 U/mL（图4-F）。n3产IAA的最适pH为6.0，产生量达到19.03 mg/L，在pH 6.0-8.0之间，菌株产IAA含量较高且相对稳定，显著高于其余pH时的产量（P＜0.05，图4-G）。n3产IAA的最佳装液量为25 mL，产量可达22.67 mg/L，显著高于其他装液量处理（P＜0.05，图4-H）。不同氮源下n3产IAA量的大小顺序为：酵母粉＞蛋白胨＞谷氨酸＞硫酸铵＞硝酸钾＞硝酸铵＞尿素。当以酵母粉和蛋白胨为氮源时，n3的IAA产生较多，分别可达32.31 mg/L和24.78 mg/L（图4-I）。

3 讨论

3.1 菌株n3产CMC酶能力及对秸秆降解的影响

从砂姜黑土中筛选出的菌株n3的产CMC酶能力高达20.60 U/mL。已研究发现多种纤维素降解菌株，如韦中等［24］分离获得的腐解菌ZJA-6表现出的CMC酶活为13.20 U/mL；李林超等［25］筛选出一株降解纤维素的放线菌C31酶活达4.8 U/mL；Liang等［26］报道的伯克霍尔德菌ME27-1在优化条件下酶活仅为2.08 U/mL。菌株n3的CMC酶活力分别是菌株ZJA-6、C31、ME27-1的1.56倍、4.29倍、9.90倍，说明菌株n3具有相对较高的CMC酶活力。需要注意的是，菌株的实际促腐应用效果需要结合CMC酶活和秸秆降解试验综合判断［27］，这是因为秸秆是由纤维素、半纤维素和木质素通过共价键、氢键和蜡键等多种分子作用力连接组成的不溶于水的高分子化合物，纤维素外部被木质素和半纤维素紧密包裹，难以被纤维素酶分解［28］。秸秆降解试验显示，菌株n3在15 d秸秆腐解率达15.1%，相对于自然降解秸秆降解率提升了54.71%，相对于韦中等［24］筛选的细菌ZJA-6在相同时间内秸秆降解率提升了28.3%，说明添加菌株n3可明显提升秸秆降解效果且优于其他菌株。由此，本研究筛选的菌株n3不仅表现高酶活性还可以加速秸秆降解的进程，在实际应用中有望提高秸秆的综合利用率。

3.2 菌株n3产IAA能力及对植物促生的影响

IAA在植物体内参与许多生理生化的调节和控制，如细胞的伸长生长、形成层细胞的分裂等，能够促进植物生长［29］。本研究从砂姜黑土中筛选出的菌株n3 的IAA分泌量可达20.15 mg/L，显著高于当前土壤中所筛菌株的平均水平［30-32］。由于植物生长随IAA浓度增大表现出低促高抑效应［33］。因此产IAA菌株的促生作用还需要结合盆栽试验综合分析。试验表明，接种菌株n3的玉米植株的SPAD值较对照显著增加。这可能是由于SPAD值表示植株的叶绿素含量，其值越高则表明植株光合作用能力越强，菌株n3属于固氮菌，接种后能够促进玉米对硝态氮的吸收积累，氮是叶绿素的重要组分，因此显著提高了玉米植株的SPAD值［19，34］。接种菌株n3的根长和平均直径增大，说明经过接菌处理的玉米形成了更为发达的根系，证实了前人关于微生物产生的IAA能促进细胞的分裂、分化和改变植物的根系形态的论点［35］；根表面积相较于对照提升不明显，可能与外源压力和土壤类型有关［36］。根系状况直接影响植物生长和营养供应，发达的根系能够充分与土壤中的养分进行交互，从而提高养分利用促进生长［19］。然而，本研究中接菌玉米的株高、地上部鲜重较对照分别增加5.0%、5.4%，未达到显著相关水平，这可能归因于植物种类和栽培条件的影响［37］。

图4 不同培养条件对菌株n3生长状况、产CMC酶活力和IAA能力的影响

3.3 菌株n3的生产和应用优化

发酵培养基为菌株的生长繁殖提供营养物质，因此对其进行优化能够最大限度促进菌株生长，缩短发酵周期，为工业生产提供参考［38］。本试验菌株n3在pH为6时生长最佳，这与菌株筛选的砂姜黑土pH为6.32相一致，然而Anandham等［39］和Han等［40］分别从牛粪、微生物燃料电池中分离出的固氮螺菌在pH为7时生长最佳，这可能与菌株筛选环境有关。环境及添加物的化学性质等，都能显著影响菌株代谢产物的活性，优化培养条件能够为微生物菌剂的应用提供理论支撑［41］。菌株n3在pH值分别为5、6时产CMC酶和IAA能力最佳，说明菌株n3有较好的耐酸能力，可在偏酸性的砂姜黑土中发挥重要作用。王霞等［42］从土壤中筛选的地衣芽孢杆菌产CMC酶最佳pH为6；张东艳等［43］从花生根际中筛选出的特基拉芽孢杆菌在pH为8时IAA产量最高，这与n3产酶和产素最佳pH不一致，可能是由于菌株种类和土壤类型的差异。本研究的最佳装液量为25 mL，随着装液量的增加，菌株生长、产酶和产素状况均呈现总体下降趋势，这可能是由于菌株n3是好氧菌，当装液量增加时，供氧量减少时，因此阻碍了菌株n3的生长，导致活菌数减少，代谢逐渐减慢，从而使得菌株分泌代谢产物的能力受到抑制。氮源对菌株的迅速增长至关重要，是满足微生物自身生长繁殖代谢等活动所必需的营养元素。在本研究中，当使用有机氮源酵母粉作为唯一氮源时，菌株n3的生长、产酶和产素效果最优，但以硝酸钾、硫酸铵、硝酸铵等无机氮源为氮源时优化效果不佳，说明有机氮源优于无机氮源，与Sheng等［44］和Jiang［45］等结果相同。

4 结论

本研究从砂姜黑土中筛获的玉米固氮螺菌n3，兼具秸秆降解和作物促生能力，其生长、产CMC和IAA最适的氮源均为酵母粉，装液量均为25 mL/250 mL，而pH分别为6.0、5.0、6.0。以上结论对指导砂姜黑土区多功能秸秆降解菌剂的创制及应用有一定的积极意义，在实际生产中菌株n3适用于土壤通气性好的微酸性土壤，最佳的配施氮肥为有机氮肥。