一株猪蓝耳病毒的分离鉴定及其全基因组序列的比较分析

罗修鑫张华伟郝根喜曾小燕周明光徐高原

（武汉科前生物股份有限公司，武汉430070）

猪蓝耳病（PRRS）能够引起母猪流产、木乃伊胎、死产和所有猪呼吸系统疾病［1］。 从20 世纪80 年代传播以来给世界养猪业带来了巨大的经济损失［2］。 猪蓝耳病毒（PRRSV）是引起PRRS 的病原，属于正链RNA 病毒，动脉炎病毒科［3］。 PRRSV基因组大概有15 kb，至少有八个ORF：ORF1a、ORF1b 和ORFs2 －7［4］。 ORF1a 和ORF1b 编码多聚蛋白，可以裂解成非结构蛋白（Nsps）：Nsp1α，Nsp1β 和Nsp2 －12［5］，ORFs2 － 7 编码结构蛋白GP2、GP3 －5、M 和N［6］。 PRRSV 分成两个基因型：欧洲型（代表毒株Lelystad virus，LV）和美洲型（代表毒株VR－2332），可以引起相似的临床症状和病理变化［7－8］。

自从1996 年我国分离出PRRSV，该病毒就广泛存在我国猪场并引起PRRS，2006 年变异的高致病性PRRSV（HP－PRRSV）在中国南方爆发PRRS，引起高热、高发病和高死亡［9－10］。 该病毒的典型特征是在Nsp2 区域有30 个氨基酸缺失。 尽管有减毒活疫苗控制HP － PRRSV，但仍有不同的HP －PRRSV 变异毒株被发现［11］。 2008 年美国国家动物疾病研究中心（NADC）首次分离并命名NADC30毒株，其病毒基因组特征与VR －2332 毒株相比，Nsp2 存在131 个不连续的氨基酸缺失，缺失模式为“111 ＋1 ＋19”。 2012 年开始，我国分离到了与美国NADC30 毒株同源性很高的毒株，到2014 年，NADC30 毒株呈现加剧的趋势，我国东北和华中地区分离到了NADC30 毒株［12］，增加了我国PRRSV的复杂性和遗传多样性。 目前，我国PRRSV 基因突变率高引起更多新的突变毒株产生，主要流行的美洲型毒株可以分成以JXAI、CH － 1a、GM2、NADC30 和VR －2332 为代表的5 个亚型［13－16］。我国PRRSV 的重组可以在野毒之间或者野毒和活疫苗毒株之间发生，进一步增加了病毒的多样性。目前这样的重组毒株有NADC30 类和JXA1 类重组（HENAN－HEB、JL580、HNhx、TJnh1501 和FJ140）等。 本研究从湖北某免疫过HP －PRRSV 疫苗的发病猪场采集病猪肺组织分离出病毒（CH－WH－19），通过设计12 对引物测出其全基因组序列并进行生物学特征分析。

1 材料与方法

1．1 试验病料 采自疑似猪繁殖与呼吸综合征的湖北某猪场发病猪的血液及淋巴结、肺脏、脾脏、肾脏等组织。

1．2 主要材料和试剂 Marc －145 细胞由实验室冻存。 DMEM 购自Gibco 公司；胎牛血清购自金源康公司；rTaq DNA 聚合酶Mix 和反转录酶均购自宝生物。

1． 3 引物设计 根据GenBank 上已发表的PRRSV 全基因序列设计12 对引物（表1）用于交叉扩增CH－WH－19 株全基因组。

表1 CH－WH－19 株全基因组扩增引物表Tab 1 Full－length genomic sequencing primers of CH－WH－19

1．4 病毒的分离与培养 采集病猪的肺脏用灭菌的生理盐水进行研磨，－80 ℃反复冻融3 次，12000 r／min 离心5 min，取上清，用0．22 μm 的过滤器进行过滤除菌。 将已长成单层的Marc －145 细胞，弃去培养液，用PBS 缓冲液清洗一次，接种1 mL 已融化的滤液，同时设正常Marc －145 细胞为空白对照，置培养箱中吸附1 ～2 h 之后取出培养瓶弃滤液，加5 mL 含2%胎牛血清的DMEM 维持液，于37 ℃5% CO2细胞培养箱中培养3 d，每天观察细胞的状态，及时收集病变细胞。

1．5 RNA 的提取及反转录 RNA 的提取按照RNA提取试剂盒说明书进行操作。 反转录体系为：5 × PrimeScript RT Master Mix 4 μL，模板16 μL，37 ℃15 min。 通过12 对重叠的引物扩增CH－WH－19 全基因组序列。

1．6 全基因组的测序比对分析及进化树分析 通过BioEdit 和MegAlign 软件比对分析序列，用MEGA7 中的N－J 法制作进化树。

2 结果与分析

2．1 病毒的分离结果 从临床收集疑似PRRSV 的56 份病料分离17 株PRRSV，扩增GP5基因测序并进行进化树分析，结果表明PRRSV－17处于NADC30 － like 毒株分支（图1），将其命名CH－WH－19，测其TCID50为106．5／mL。

图1 分离的17 株PRRSV GP5 基因进化树分析Fig 1 Phylogenetic analysis of 17 isolated PRRSV based on GP5

病毒分离过程中，盲传第三代出现病变，细胞圆缩，聚集，随着培养时间的延长细胞聚集成堆，最后细胞破碎，脱落，用间接免疫荧光检测出现特异的绿色荧光（图2）。

图2 CH－WH－19 株的细胞病变及间接免疫荧光结果Fig 2 CPE and immunofluorescence of CH－WH－19

2．2 基因组特征及同源性分析 CH－WH－19 基因组全长14993 bp，包括5’UTR 189 bp，3’UTR 152 bp 和8 个ORF。 与NADC30、JXA1、CH －1a、VR － 2332 和GM2 的 同 源 性 分 别 为91． 9%、84．3%、83．9%、83．3%和80．5%，但是与欧洲型的毒株Lelystad virus 相似性仅有58．9%（表2），说明分离的毒株属于美洲型。 为了分析分离的新毒株的基因特征，我们分别比较了CH － WH － 19与NADC30、JXA1、CH －1a、VR －2332、GM2 和LV毒株的5’UTR、3’UTR 和8 个ORF 的同源性，结果显示与NADC30 和JXA1 毒株不同ORF 同源性较高，分别是88． 6% ～97． 4%和81． 8% ～94． 7%，与CH－1a 的同源性是80． 5% ～91． 9%，而与GM2 和VR－2332 毒 株 的 同 源 性 较 低 分 别是74．9% ～90．0%和79． 6% ～90． 7% （表2）。CH－WH－19 ORF1a 和ORF1b 的大小分别是7095 bp 和4383 bp，分别与美洲型毒株的同源性是74．9% ～88．6%和86．2% ～94．7%，但与欧洲型LV 毒 株 同 源 性 仅53． 9% 和63． 3% （表2）。CH－WH－19 ORF2 ～ORF7 大约占全基因组的1／4，编码结构蛋白（GP2 ～GP7），其中变异最大的结构蛋白基因ORF2、ORF3 和ORF5 与美洲型毒株的同源性分别是84．3% ～93．9%，82．1% ～94．6%和84．3% ～93．5%（表2）。

表2 CH－WH－19 与其他毒株的同源性比较Tab 2 Nucleotide identity of CH－WH－19 compared with other strains

2．3 Nsp2 基因分析 NADC30 基因型毒株的基因组特征主要表现为Nsp2 存在“111 ＋1 ＋19”个氨基酸缺失，CH －WH －19 毒株与参考毒株的Nsp2 基因氨基酸比对结果显示，CH －WH －19 与NADC30毒株一样分别在322 ～432、481 和530 ～549 的位置出现了“111 ＋1 ＋19”个氨基酸缺失（图3）。

图3 CH－WH－19 与参考毒株部分Nsp2 基因氨基酸比对Fig 3 Alignment of the partial Nsp2 amino acid sequence of CH－WH－19 with reference strains

2．4 ORF5 基因分析 CH －WH －19 毒株与参考毒株ORF5 氨基酸序列比对存在一定的差异（图4）。 CH －WH －19 毒株与参考毒株ORF5 氨基酸序列1 ～26 位置的26 个氨基酸是信号肽，63 ～83、95 ～102 和110 ～127 分别是三个跨膜区（TM1、TM2 和TM3）的位置。 在GP5 蛋白的第13 和151位与毒力相关的氨基酸处，CH －WH －19 在第13位与JXA1、CH－1a 和VR－2332 保持一致（R13），但151 位与NADC30 和GM2 保持一致（K151）。A137 是疫苗株VR － 2332 的标志，但分离的CH－WH－19毒株突变成了S。 N30、N34、N44 和N51 是四个潜在的N －糖基化位点，一些研究表明与病毒感染和抗原特征有关系，CH－WH－19 毒株N34 突变成了D，其他的三个位点很保守。

图4 CH－WH－19 与参考毒株GP5 基因氨基酸序列比对Fig 4 Alignment of GP5 amino acid sequence of CH－WH－19 with reference strains

2．5 进化树分析 为进一步研究CH －WH －19与其他PRRSV 毒株的基因关系制作了全基因组序列的进化树（图5），结果显示所有的全基因组分成两个大分支美洲型和欧洲型，本研究的CH－WH－19和NADC30 处于同一分支，表明CH－WH－19属于NADC30 型毒株。

图5 CH－WH－19 和参考毒株全基因组进化树分析Fig 5 Phylogenetic analysis of complete genome of CH－WH－19 and reference strains

3 讨论与结论

自从1996 年中国分离到第一株蓝耳病毒CH1a，猪蓝耳病毒引起猪严重疾病也给我国养猪产业带来严重经济损失。 2006 年，我国南方大面积暴发高致病性猪繁殖与呼吸综合征，至今该病已在全国大范围存在，对我国的养猪业来说更是雪上加霜。 本实验室从湖北某发病猪场分离到1 株PRRSV，命名为CH － WH －19，进行了全基因组测序，并分析它们的基因特征。 同源性分析显示CH－WH－19 与美洲型标准毒株（VR－2332）和欧洲型标准毒株（LV）的相似性分别为83． 3% 和58．9%，说明该毒株属于美洲型毒株。 该毒株与NADC30 型PRRSV 毒株基因序列同源性高达91．9%，且进化树结果显示与NADC30 毒株处于一个分支这都说明CH －WH －19 属于NADC30 型毒株。 CH－WH－19 与参考毒株Nsp2 基因的氨基酸比对发现，与NADC30 毒株一样分别在322 ～432、481 和530 ～549 的位置出现了“111 ＋1 ＋19”的氨基酸缺失，也可以推测CH － WH － 19 株属于NADC30 型毒株。

由于PRRSV 引起免疫抑制导致宿主很难彻底清除病毒。 在免疫应答的过程中，PRRSV 为了抵抗机体产生的抗体，就会产生越来越多的变异。 尽管现在有变异的毒株制备的疫苗预防猪蓝耳病，但猪蓝耳病仍然在不同的猪场流行，可能是由于PRRSV 易突变引起PRRSV 致病性的改变，因此蓝耳病毒的分离与基因分析仍然很重要。 本研究分离的CH －WH －19 株属于NADC30 型PRRSV，目前还没有出现NADC30 型的变异株疫苗，因此，本研究可为猪蓝耳病新疫苗的研发提供基础材料。