N6-腺苷酸甲基化RNA修饰在免疫调控中的作用

上海交通大学医学院附属仁济医院肾脏科，上海200127

在生物系统中，RNA同时具有信息分子和调控分子的双重身份，不仅将遗传信息从DNA传递到蛋白质，同时调控着许多生物学过程，其中RNA的转录后修饰是这种多样化调控功能的基础[1]。在真核生物中，N6-腺苷酸甲基化（N6-methyladenosine，m6A）是mRNA内部序列中最常见的一种甲基化修饰。通过甲基酶作用于第6位N原子，使其发生甲基化，从而影响mRNA的剪接、稳定、运输、出核、定位、翻译等过程[2-5]。近年来，随着高通量测序技术及其他化学分析技术的兴起，RNA甲基化的研究取得了突破性的进展，m6A作为最常见的mRNA甲基化修饰，成为了表观转录组学的研究热点。本文就近年来有关m6A及其在免疫调控中作用的相关研究作一综述。

1 m6A的发现及分布

1974年，Desrosiers等[6]首次在具有poly（A）片段的RNA中发现了mRNA的甲基化修饰，其中最主要的是m6A。哺乳动物RNA分子中发生甲基化修饰的腺苷酸占0.1%～0.4%，相当于每个mRNA分子存在3～5个m6A修饰位点[7]。然而，由于研究技术的限制，m6A在转录组水平的分布及其生物学功能一直未阐明。2011年，美国芝加哥大学一项研究[8]发现肥胖相关蛋白（fat mass and obesity-associated protein，FTO）可以去除m6A的甲基化修饰，证明m6A修饰是一种动态、可逆的过程。类似于DNA和组蛋白甲基化修饰在表观遗传调控中的重要作用，m6A可能具有同样重要的调控功能，因而引起了研究者们的重新关注。2012年，2项分别发表在Nature和Cell的独立研究[2,9]首次在人类和小鼠转录组水平上阐明了m6A的分布，研究结果显示m6A广泛存在于哺乳动物7 000余种mRNA以及300余种长链非编码RNA转录组中，主要在终止密码子附近、3′端非编码区和mRNA内部长外显子富集，在人类和小鼠mRNA中具有高度保守性。

2 m6A相关酶的组成

m6A是一种动态、可逆的甲基化修饰，此修饰过程受甲基转移酶（writers）、去甲基酶（erasers）和甲基化阅读蛋白（readers）的共同调节。

2.1 m6A甲基转移酶

甲基转移酶是催化mRNA上的碱基发生甲基化修饰的一类酶，又称为“writers”。m6A的甲基转移酶是由多种蛋白质组成的复合物，利用S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）为甲基供体，将腺嘌呤的第6位N原子上的氢甲基化，形成m6A。METTL3是最早发现的甲基转移酶，最初被命名为MT-A70，具有SAM结合活性，在真核生物中具有高度保守性[10]。敲除METTL3后m6A甲基化修饰几乎全部丧失[11]，因此，METTL3是m6A甲基转移酶复合物关键的组成部分，也是目前发现的唯一能与SAM结合的甲基转移酶。METTL14是与METTL3高度同源的另一甲基转移酶，但METTL14缺乏SAM结合区域，无法与SAM结合，主要在识别底物RNA及定位上起到关键作用，并且与METTL3形成络合物增强甲基酶的活性[10,12]。WTAP是m6A甲基转移酶复合物另一个重要组成成分。WTAP同样缺少SAM结合区域，无甲基转移酶活性，通过与METTL3和METTL14结合将甲基转移酶复合物定位在核散斑上来调控甲基转移酶复合物与靶标RNA的结合，从而影响m6A的表达。WTAP缺失会抑制METTL3和METTL14在核散斑上的定位，导致m6A水平显著降低[13]。因此，METTL3、METTL14、WTAP三者的结合是m6A甲基转移酶复合物的中心活性组分。

KIAA1429和RBM15/15B是在WTAP的蛋白质组学分析中发现的甲基转移酶，下调KIAA1429、RBM15或RBM15B均可导致m6A水平大幅度降低；但目前对于KIAA1429如何影响甲基转移酶复合物以及在m6A形成中的作用，尚未明确[14]。RBM15/15B可通过与m6A修饰位点附近的U富集区结合，从而招募甲基转移酶复合物至甲基位点发挥甲基化功能[15]。METTL16是近来发现的一种m6A形成酶，主要在U6小核RNA和甲硫氨酸腺苷转移酶2A mRNA进行RNA甲基化修饰[16]。

2.2 m6A去甲基酶

去甲基酶的发现是m6A研究领域的重大突破。m6A去甲基酶又称“erasers”，其作用是将m6A转化为腺苷酸。FTO最早作为肥胖相关蛋白被发现，是AlkB双加氧酶家族成员，大部分定位于核斑点，核内RNA是FTO主要酶活性底物。沉默FTO可导致m6A的总体水平显著升高，而FTO过表达可使得m6A水平下降[8]。Li等[17]研究发现，FTO作为m6A的去甲基酶在急性髓细胞性白血病（acute myeloid leukaemia，AML）中具有致癌作用。然而，2017年康奈尔大学研究团队[18]在Nature上发表文章提出，与m6A非常相似的N6,2-O-二甲基腺苷（N6,2′-Odimethyladenosine，m6Am）修饰的去甲基酶也是FTO，而且FTO对m6Am的酶活性是m6A的100倍；因此，FTO虽然能将m6A去甲基化，但其真正的活性底物可能是m6Am。目前，关于FTO的功能仍然具有一定争议。ALKBH5是AlkB家族另一具有m6A去甲基酶活性的蛋白质，主要定位于细胞核，核内mRNA及其他核内的非编码RNA是其主要的酶活性底物。与FTO不同，ALKBH5对m6Am无催化活性。Alkbh5基因敲除的小鼠表现出明显的精子形成障碍，可能与减数分裂中期的精母细胞凋亡增加有关，ALKBH5可能通过调控m6A影响精子的形成[19]。

2.3 m6A甲基化阅读蛋白

发生m6A修饰的RNA需与相应的结合蛋白结合才能发挥特定的生物学功能，这类蛋白又称为阅读蛋白——“readers”。目前已知的阅读蛋白主要包括YTH结构域蛋白、真核起始因子（eIF3）和HNRNPA2B1。

哺乳动物基因组中包含两大类YTH结构域蛋白，分别是DC家族的YTHDC1、YTHDC2以及DF家族的YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3。3种YTHDF蛋白结构非常相似，主要分布在细胞质，能够与mRNA的所有m6A修饰位点结合[2,4]。YTHDF2是研究最早的阅读蛋白，广泛存在于各种细胞中，通过招募CCR4-NOT腺苷化酶复合物将m6A结合使所在的RNA降解[20]。YTHDF1与eIF3及其他翻译起始因子相互作用，参与蛋白翻译过程[5]。YTHDF3的调控功能尚不明确。YTHDC类蛋白主要分布在细胞核，DC1与未成熟的mRNA及一些核内非编码RNA结合，通过YTH区域介导m6A调控mRNA的剪切[3]。关于DC2的研究较少，研究[21]显示，YTHDC2可能是结肠癌的诊断标志物和治疗的靶基因。

eIF3是翻译起始前复合物的一个组成部分，结合在m6A的5′-UTR上介导mRNA的翻译起始。eIF3可通过2种模式介导m6A调控mRNA的翻译过程。一种是m6A直接结合并招募eIF3至5′-UTR[22]，另一种是由YTHDF1与在终止密码子附近的m6A结合从而招募eIF3至5′-UTR[5]，具体机制尚不明确。HNRNPA2B1主要分布在细胞核中，参与微小RNA前体（pre-microRNA，pre-miRNA）的剪接和加工[2]。研究[23]发现，胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白可与m6A结合促进mRNA的稳定和蛋白翻译，是m6A的另一种阅读蛋白。

3 m6A的生物学功能

3.1 m6A影响mRNA成熟

从核内的加工到细胞质的翻译和降解，m6A几乎影响mRNA的每一阶段。进行选择性剪接的mRNA具有更多的METTL3结合位点和m6A位点[2]。沉默小鼠胚胎干细胞Mettl3通常导致外显子跳跃和内含子保留剪接异常[11]。FTO可通过去除剪接位点周围的m6A以及抑制与富含丝氨酸和精氨酸的剪接因子2（serine/arginine-rich splicing factor 2，SRSF2）的结合来调控选择性剪接。YTHDC1通过招募SRSF3，同时阻断SRSF10的结合，导致外显子增加[3]。因此，m6A在mRNA的剪接加工方面具有重要的作用，从而影响mRNA的成熟。

3.2 m6A参与mRNA的运输

mRNA从核内输出是连接核内转录、加工与细胞质内翻译的关键一步，能够选择性地调控基因的表达。METTL3的缺失可以抑制mRNA的输出，而ALKBH5的缺失可以促进mRNA向细胞质输出，因此m6A具有促进mRNA向细胞质输出的作用。并且，研究者认为，促进mRNA向细胞质输出可能是m6A调控基因表达的主要机制[19,24]。

3.3 m6A调控mRNA翻译效率

m6A促进蛋白翻译的作用主要与YTHDF1有关。YTHDF1通过与m6A修饰的mRNA结合，并且招募eIF3，显著提高翻译效率。YTHDF1不仅将甲基化的转录物与核糖体偶联，同时还募集翻译起始因子来加快翻译的限速步骤[5]。近期，研究[25]发现，METTL3同样具有m6A阅读蛋白的作用，通过在翻译起始期间募集eIF3促进特定亚群mRNA中eIF4E依赖的翻译。

3.4 m6A参与mRNA降解

在人类和小鼠细胞中敲除METTL3和METTL14基因后，相应的mRNA水平却显著提高，表明m6A与mRNA的稳定性有关[26]。一般来说，m6A作为mRNA的不稳定剂发挥作用，促进甲基化mRNA在各种生物环境中的降解。YTHDF2是第一个发现的以m6A依赖方式降解mRNA的蛋白。YTHDF2蛋白的羧基端YTH结构域可选择性地与甲基化转录物结合，通过氨基末端的功能结构域将结合的转录物传递到细胞质RNA降解机制区进行降解[4]。

4 m6A参与免疫调控

4.1 m6A参与机体固有免疫反应

2005年，Karikó等[27]发现，暴露于RNA修饰如m6A的树突状细胞表达的细胞因子及活化标志物显著低于不含m6A的细胞。DEAD-box（DDX）螺旋酶对于RNA的识别和代谢至关重要，也是启动机体抗病毒固有免疫的关键。研究[28]发现，核内DDX蛋白质家族成员DDX46可抑制病毒感染后Ⅰ型干扰素的产生。在病毒感染后，DDX46通过DEAD螺旋酶结构域招募ALKBH5使得m6A修饰的抗病毒转录物去甲基化，导致转录物滞留于细胞核，抑制蛋白翻译。因此，DDX46可通过消除m6A修饰将选定的抗病毒转录物滞留在细胞核中，从而抑制抗病毒固有免疫反应。近期，研究[29]发现，在树突状细胞（dendritic cells，DCs）中，m6A通过YTHDF1调控肿瘤免疫反应。与野生型小鼠比较，Ythdf1基因缺陷型小鼠抗原特异性CD8+T细胞抗肿瘤免疫反应显著增强，经典DCs中YTHDF1的缺失可显著增强肿瘤抗原的交叉呈递和CD8+T细胞的交叉激活作用。因此，YTHDF1可作为抗肿瘤免疫治疗的潜在靶点。

4.2 m6A调控初始T细胞稳态和分化

初始T细胞在不同的特定条件下可分化为不同的T细胞亚群。2017年Li等[30]在Nature首次报道，m6A通过靶向初始T细胞IL-7/STAT5/SOCS信号通路中的信号分子影响T细胞的稳态。研究发现，Mettl3基因敲除小鼠来源的初始T细胞分化为辅助性T细胞（helper T cell，Th）1和Th17细胞比例显著减少，Th2细胞比例显著增多，而调节性T细胞（regulatory T cells，Treg）比例无显著变化。将这种初始T细胞转输至肠炎模型中，初始T细胞将无法进行稳态增殖和分化，维持初始状态长达12周，从而抑制小鼠慢性肠炎的发生。该研究首次揭示了m6A修饰在哺乳动物T细胞介导的肠炎中的重要作用。进一步研究发现，m6A通过促进细胞因子信号转导抑制物（suppressor of cytokine signaling，SOCS）蛋白家族mRNA降解，来调控IL-17/STAT5信号通路介导的初始T细胞稳态增殖和分化。

4.3 m6A维持Treg细胞免疫抑制功能

Treg是一类具有免疫抑制功能的由初始T细胞分化而来的CD4+T细胞。有研究[31]发现，m6A具有维持Treg细胞免疫抑制功能的作用。该研究显示Treg细胞特异性缺失Mettl3的小鼠，在断乳后表现出外周淋巴结肿大、脾肿大、脱发等严重自身免疫性疾病的表现。出生后10 d和20 d的Mettl3缺失小鼠的Treg细胞在脾和胸腺的比例、数量与野生型小鼠无明显差异；但在60 d时由于过度炎症而衰竭，并且Mettl3缺失的Treg细胞免疫抑制功能显著降低。类似于m6A调控初始T细胞的机制，研究者同样发现敲除Mettl3可导致特定Socs基因转录物中m6A修饰减少，使得SOCS家族蛋白mRNA表达上调，从而抑制与Treg细胞抑制功能相关的IL-2/STAT5信号通路，使得Treg抑制功能丧失。因此，m6A在调控T细胞分化及维持Treg细胞抑制功能中具有重要的作用，表明m6A可能是自身免疫性疾病治疗的一个新靶点。

5 m6A与疾病的关联性

5.1 m6A与肿瘤

m6A在基因表达调控中的重要作用表明了其可能参与了肿瘤的发生。目前，在肝细胞癌[32]、肾癌[33]以及AML[17]等多种肿瘤中均发现异常的m6A修饰及其在肿瘤发生、发展中的重要作用。Gong等[33]研究发现，m6A在肾细胞癌组织RNA中显著降低，METTL14通过调控m6A修饰水平减少ATP受体P2RX6蛋白翻译从而抑制肾细胞癌转移。Li等[17]发现，FTO高表达于AML的t(11q23) /MLL-重组、t(15;17)/PML-RARA、FLT3-ITD或NPM1突变亚型中。FTO可通过降低AML转录物中m6A水平，调节ASB2、RARA等靶基因的表达，促进白血病癌基因介导的细胞转化和白血病发生，并抑制全反式维甲酸（alltrans retinoic acid，ATRA）诱导的AML细胞分化。因此，异常的m6A修饰与肿瘤的发生、发展密切相关。

5.2 m6A与心血管疾病

心血管疾病是慢性肾脏病主要的并发症和死亡原因。Dorn等[34]发现，心肌细胞METTL3表达增加可导致心脏代偿性肥大，但不影响心脏功能，而METTL3基因敲除可诱导心肌重构，并表现出心脏衰竭的形态学和功能性的体征。Mathiyalagan等[35]提出，FTO可选择性地去甲基化心肌收缩转录物，从而防止其降解并提高其在缺血时的蛋白表达。此外，在心肌梗死小鼠模型中FTO的过表达可降低纤维化和增加血管生成。单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）在人类基因组中广泛存在。研究[36]显示，m6A相关的SNPs可能与冠状动脉粥样硬化性心脏病的发病机制有关，其中SNP rs12286在全基因组与该病显著相关。

5.3 m6A与糖尿病

糖尿病是继发性肾病的主要病因之一。研究[37]显示，m6A可能是2型糖尿病的新型标志物。与对照组比较，2型糖尿病患者及糖尿病大鼠的RNA中m6A含量显著降低，并且2型糖尿病患者FTO的mRNA表达量显著高于对照组。Yang等[37]研究发现，糖尿病患者与FTO血糖水平呈正相关，并且在人肝癌细胞中，高血糖水平可显著上调FTO蛋白表达量。因此，高血糖水平可能是导致2型糖尿病患者FTO表达增加的刺激因子。

5.4 m6A与自身免疫性疾病

自身免疫性疾病是一类由于机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害的疾病，也是继发性肾脏疾病的主要病因之一。基于在免疫调节尤其是T细胞稳态和分化中的重要作用，m6A可能与自身免疫性疾病的发病机制息息相关。目前，已有研究[38]显示m6A相关的SNPs（m6A-associated SNPs，m6A-SNPs）可能在类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）的发病中扮演重要的角色；该研究共发现37个在亚洲或欧洲人的全基因组水平上与RA显著相关的m6A-SNPs，其中包括编码主要组织相容性复合体的基因，如C6orf10中的rs1033500和HLA-DPB1中的rs1042136，为研究m6A与RA以及自身免疫性疾病之间的关系提供了新的思路。

6 总结与展望

目前，m6A作为真核细胞中最常见、最丰富的mRNA转录后修饰，已经得到了研究者们的广泛关注。甲基转移酶、去甲基酶以及阅读蛋白调控的动态可逆的甲基化过程是m6A表观遗传调控功能的基础。m6A在免疫细胞分化及调控功能中的重要作用表明其可能是免疫相关性疾病治疗的一个新靶点。因此，进一步研究m6A在免疫相关性疾病及其继发的肾病中的作用，可能为该类患者的治疗带来新的希望。