PCOS患者血清中VEGF表达及与VEGF基因位点rs2010963G/C多态性遗传易感性分析

朱春仁 刘爱胜 何广营 张 燕

(深圳市龙华区人民医院妇产科，深圳 518109)

多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是以月经稀发或闭经、无排卵及不孕等为主要临床表现的一种育龄妇女常见的内分泌紊乱性代谢疾病，其发病率为5%～10%。PCOS患者除有多毛、痤疮及肥胖等高雄激素血症和卵巢多囊性特征外，还常伴有胰岛素抵抗和2型糖尿病等代谢综合征[1-3]。PCOS发病与多种因素有关，但至今为止，其发病机制尚未阐明。有研究表明，PCOS 是一种复杂的多基因遗传性疾病，与人体内多种基因位点突变有关。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是一种有效的血管生成因子和细胞内皮分裂原，是促进血管生成和增加血管通透性的重要因子之一。有关研究表明，VEGF浓度在PCOS患者血清中明显升高，且VEGF基因在PCOS患者卵巢基质中也呈高度表达，表明VEGF基因在PCOS的病理生理学中起重要的作用，同时不同地区和种族人群因遗传背景和环境的不同，会导致基因突变存在一定的区域性和种族性差异[4-7]。为此，本研究对深圳市龙华区109例PCOS患者血清中VEGF表达及其位点rs2010963G/C基因多态性进行了研究，现报道如下。

1 资料与方法

1.1资料

1.1.1研究对象 收集2017年3月～2019年3月医院门诊妇科就诊并确诊为PCOS患者109例，年龄18～42岁，平均年龄(29.26±12.73)岁。PCOS患者诊断参照美国生殖医学学会(ASRM)鹿特丹工作组修正的诊断标准[8]：①稀发排卵或无排卵；②临床或生化有高雄激素血症的表现；③经阴道超声检查有多囊性卵巢(每个卵巢的直径为2～9 mm，且存在≥12个卵泡或卵巢体积≥10 ml)，符合其中2项或以上才能诊断为 PCOS，并排除先天性肾上腺增生、高泌乳素血症和雄性激素分泌型肿瘤等疾病。选择同时期来院体检的健康育龄妇女120例，年龄19～40岁，平均年龄(28.72±11.67)岁，均有正常的月经周期和至少1次成功的怀孕史，且没有任何内分泌紊乱疾病和糖尿病家族史，超声检查未见多囊性卵巢。两组研究对象3个月内均无激素治疗史，且均无内外科及其他疾病史，两组研究对象的一般性资料之间差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经医院医学伦理委员会同意批准，且所有研究对象知情同意。

1.1.2仪器与试剂 ABI7500 PCR基因扩增仪由美国ABI公司提供；DNA提取试剂由深圳亚能生物技术有限公司提供；VEGF试剂盒由上海康朗生物科技有限公司提供；AE275全自动酶联免疫分析仪由深圳爱康科技有限公司提供。

1.2方法

1.2.1标本采集 于清晨空腹采集静脉血4～5 ml，其中2 ml加入EDTA-K2一次性抗凝管内混匀，用于VEGF基因位点rs2010963G/C多态性分析，其余加入一次性无抗凝剂干燥管内，室温静置30 min后离心分离血清用于VEGF水平检测。

1.2.2VEGF水平检测 采用双抗体夹心ELISA法检测血清中VEGF水平，所有操作严格按仪器和试剂盒说明书及科室SOP操作规程，并在同等条件下进行，确保两组VEGF水平检测结果的准确性和可比性。

1.2.3DNA提取 采用DNA提取试剂盒提取全血中DNA，所有操作均严格按照试剂盒说明书进行，DNA提取完成后通过电泳检测其是否完整，并采用紫外分光光度仪检测其浓度以及纯度，合格后置于-20℃保存备用。

1.2.4多态性分析 ①引物设计：上游引物：5′-AGAGACGGGGTCAGAGAGAG-3′，下游引物：5′-TCCGGCGGTCACCCCCAAAA-3′。②PCR扩增体系：反应总体积为15 μl，其中模板DNA 0.5 μl，10×PCR缓冲液1.5 μl，5 U/μl耐热DNA聚合酶0.1 μl，10 mmol/L dNTP 0.3 μl，50 pmol/μl的上、下游引物各0.2 μl，25 mmol/L MgCl21.2 μl，dH2O 11 μl。③PCR扩增条件：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，68℃退火45 s，72℃延伸60 s，共循环20次，最后72℃延伸6 min。④电泳：酶切反应体积为15 μl，其中PCR扩增产物10 μl，10 U/μl限制性内切酶0.1 μl，混匀于37℃水浴箱内过夜，然后于30 g/L的琼脂糖凝胶内150 V电泳30 min，分析其基因型。

2 结果

2.1两组血清中VEGF水平比较 PCOS组患者血清中VEGF水平为(185.29±37.60)pg/ml，明显高于对照组的(91.07±23.56)pg/ml，差异有统计学意义(t=6.402 7，P<0.05)。

2.2VEGF位点rs2010963G/C基因单核苷酸多态性比较 PCOS患者血清中VEGF位点rs2010963G/C的GG基因型及G等位基因检出率分别为54.13%和66.97%， 明显高于对照组的29.17%和44.58%，差异有统计学意义(χ2=3.790 5～4.520 9，P<0.05)，结果见表1。

表1 PCOS组和对照组血清中VEGF位点rs2010963G/C基因多态性比较[例(%)]Tab.1 Comparison of polymorphism of VEGF locus rs2010963G/C in serum between PCOS group and control group[n(%)]

2.3电泳分析 经PCR扩增后可获得145 bp大小的目的片段，经2%琼脂糖凝胶电泳VEGF基因位点rs2010963分别于145、107及38 bp处显色检出CC、GC及GG 3种基因型条带，结果见图1。

图1 VEGF基因位点rs2010963扩增产物电泳图Fig.1 Electrophoresis results of amplification product of VEGF gene rs2010963Note:M.Marker;1，2，4，5，6，7 were GC genotypes.3 was CC genotype;8 was GG genotype.

2.4PCR扩增产物酶切电泳结果 对部分抽样PCR扩增产物进行基因测序，结果见图2。

图2 VEGF基因位点rs2010963多态性测序结果Fig.2 Sequencing results of VEGF gene locus rs2010963 polymorphism

2.5不同基因型PCOS患者血清中VEGF水平比较 GG基因型PCOS患者血清中VEGF水平为(278.35±51.02)pg/ml，明显高于GC和CC基因型(206.18±40.95和142.73±29.86)pg/ml，差异有统计学意义(t=4.918 2～6.074 3，P<0.05)。

3 讨论

PCOS是一种涉及生殖、内分泌和代谢等多系统的复杂性疾病，具有高度异质性和病因复杂性的特点，主要表现为高雄激素血症、稀发排卵或无排卵、胰岛素抵抗及卵巢多囊样改变，是无排卵性不孕的主要原因。若PCOS病情不控制任其长期发展，患者将伴发糖尿病、高血压、高血脂及心血管疾病等多种代谢相关性疾病，给育龄妇女的生理、心理、经济和生活均造成极大的影响[5,9]。PCOS发病机理目前尚未完全阐明，但多数研究者认为，PCOS发病是致病基因位点突变与环境因素共同作用所导致的[10-12]。因此，加强PCOS发病机制研究，对PCOS患者的诊断、治疗及预防具有重要意义。

VEGF是由多数肿瘤细胞、伤口中角质细胞及巨噬细胞所产生的一种有效的血管生成因子和细胞内皮分裂原，是促进血管生成和增加血管通透性的重要因子之一。有研究表明，PCOS患者血清中VEGF水平明显升高[7，13]。本研究结果显示，深圳龙华区PCOS患者血清中VEGF水平明显高于对照组健康育龄妇女，差异有统计学意义(P<0.05)，与有关文献报道相一致[7,13]。这可能与VEGF促进卵巢内膜微血管新生和增加其通透性有关，从而引起卵巢基质细胞的异常生长，使得卵泡内膜细胞产生大量的雄性激素与VEGF维持卵巢滤泡周围血流和调节滤泡内氧浓度等，具体机制有待进一步研究。

PCOS发病是遗传和环境因素共同作用所引起的，其中遗传因素在PCOS发生和发展中发挥着重要的作用[14]。研究表明，PCOS发病与多种基因位点突变有关，且不同地区和种族人群因遗传背景和环境因素的不同可能导致结果不一致[15，16]。VEGF基因位于人类6号染色体的短臂2区1带3亚带，由8个外显子和7个内含子组成，是一种肝素结合糖蛋白。有关文献表明，VEGF基因突变与PCOS发生和发展有密切相关性，且不同地区和种族人群VEGF基因突变结果存在一定差异[17，18]，如Vural等[19]报道VEGF基因位点rs2010963G/C突变与土耳其PCOS患者之间无密切相关性，而黄茜等[13]报道的我国河北地区及Guruvaiah 等[20]报道南印度地区VEGF基因位点rs2010963G/C突变与PCOS患者之间密切相关。本研究结果显示，深圳龙华区PCOS患者血清中VEGF基因位点rs2010963G/C多态性以GG基因型及G等位基因检出率最高，明显高于GC、CC基因型及C等位基因，差异有统计学意义(P<0.05)，与有关文献研究的结果之间存在一定的差异，表明不同地区和种族人群之间基因突变的差异性[7,13，19，20]。因此，SNP位点突变相关研究应充分考虑研究对象的地域性和种族差异性，使研究结果更可靠、更具有代表性[20，21]。本研究结果还显示，VEGF基因位点rs2010963G/C GG基因型PCOS患者血清中VEGF水平明显高于GC和CC基因型，差异有统计学意义(P<0.05)，这与VEGF基因启动子区的 SNP 位点可能通过改变转录因子和基因启动子的结合作用，进而调节VEGF 基因的表达水平有关。

综上所述，PCOS患者血清中VEGF水平明显升高，VEGF基因位点rs2010963G/C分布呈多态性，不同基因型PCOS患者血清中VEGF水平存在很大差异，且具有地域性和种族性。因此，加强不同地区和种族人群VEGF水平及其相关基因位点多态性分析，对PCOS患者的诊断、治疗及预防具有十分重要的意义。