氧化三甲胺致动脉粥样硬化作用与胆固醇代谢有关

郝祥宇，郭建强

(内蒙古医科大学附属医院心内科，内蒙古 呼和浩特)

心血管疾病(CVD)是目前人类面临的主要死亡原因之一，而动脉粥样硬化(AS)是许多心血管疾病的常见病理基础。近年来，肠道微生物在动脉粥样硬化形成过程中的作用得到越来越多的重视。人类肠道微生物代表着超过100万亿个微生物和5000个不同的物种，总共包含大约500万个基因[1]。这些基因对我们正常生理功能的维持及新陈代谢具有重要意义[2]。一旦肠道微生物的生态环境出现失衡，会导致多种疾病。例如，心血管疾病，肥胖，2型糖尿病等。另外，肠道微生物对血脂水平的代谢也有重要影响。

动脉粥样硬化起始于低密度脂蛋白(LDL)的氧化修饰，单核细胞吞噬被修饰的低密度脂蛋白进一步分化为巨噬细胞，更多的被修饰的LDL通过巨噬细胞表达的清道夫受体被摄取，发育成为泡沫细胞，沉积于动脉血管壁。动脉粥样硬化是动脉壁上的一种慢性炎症反应，表现为动脉壁斑块形成，管腔狭窄。在旨在改善动脉粥样硬化的靶点中，消除体内过量的胆固醇沉积为一个有效的途径[3]。

通过代谢组学及液相色谱质谱分析(LC / MS)发现肠道微生物代谢产物氧化三甲胺(TMAO)与心血管疾病相关[4]。为了验证TMAO的致动脉粥样硬化作用，将断奶C57BL/6J.Apoe-/-小鼠分为普通饲料(总胆碱含量为0.08～0.09%)、普通饲料中添加中量胆碱(0.5%)、添加高浓度胆碱(1.0%)或TMAO(0.12%)喂养组，在20周龄时，雄性和雌性小鼠在补充胆碱或TMAO的饮食中都发现了增强的主动脉粥样硬化斑块，对每组膳食中血浆TMAO进行分析，发现TMAO水平显著增加，并且所有饮食组小鼠的血浆TMAO水平与动脉粥样硬化斑块大小呈显著正相关。在两个不同的人群研究队列中，发现氧化三甲胺血浆水平与增加主要心血管不良事件(MACE)和死亡率的风险呈正相关[5]。有研究[6]证实，TMAO独立且比传统心血管疾病风险因子在更早的阶段提示心血管疾病的风险，可将其作为新型心血管疾病的风险因子。

氧化三甲胺(TMAO)是主要来源于胆碱、左旋肉碱以及其他含胆碱的化合物为前体的产物，它们来自富含磷脂酰胆碱的食物，包括红肉、家禽、鱼和鸡蛋[7]，由肠道微生物通过三甲胺裂解酶(分别为CutC/D、CntA/B及YeaW/X)代谢为三甲胺(TMA)。TMA可以在肠道中吸收并通过门脉循环传递到肝脏，被肝脏黄素单加氧酶3 (FMO3)转化为TMAO[8]，FMOs家族包含5种FMO基因，在TMA向TMAO转化中，FMO3效率最高。当FMO3发生基因突变时，TMA转化为TMAO过程不能正常进行，体内过多的TMA由尿液、汗液等排出体外，散发出鱼腥臭味，称为“鱼腥味综合症”[9]。除了在肝脏中表达外，FMO3还在肺、肾上腺和主动脉中表达。有趣的是，在老鼠和人类身上都观察到了女性比男性表现出更高的表达[10,11]。

TMAO可能通过以下途径促进动脉粥样硬化的发展：

(1)TMAO上调清道夫受体CD36、SR-A1，促进泡沫细胞形成

在断奶时给予C57BL/6J.Apoe-/-小鼠添加TMAO的饮食(＞3周)，与正常饮食相比，补充TMAO饮食的小鼠其腹腔巨噬细胞清道夫受体CD36和SR-A1的mRNA和表面蛋白水平升高[4]，这说明TMAO可上调巨噬细胞清道夫受体，促进泡沫细胞形成。进一步研究了膳食胆碱和肠道菌群对高胆固醇巨噬细胞泡沫细胞形成的影响，将C57BL/6J.Apoe-/-小鼠分为对照组(饲料胆碱含量0.07-0.08%)，高胆碱组(饲料胆碱含量(1.0%)。同时，半数小鼠给予广谱抗生素治疗3周，以抑制肠道微生物。结果表明，半数小鼠服用广谱抗生素3周后，肠道微生物受到抑制，血浆TMAO水平降低了100倍以上。腹腔巨噬细胞的油红O染色显示，对照组小鼠有少量的内源性巨噬细胞泡沫细胞形成，而补充1%胆碱的小鼠则显著促进了富含脂质的巨噬细胞的发育，而对照组小鼠腹腔巨噬细胞的油红O染色表明，添加1%胆碱的小鼠显著促进了高脂巨噬细胞的发育(图5A)。相反，抑制肠道微生物显著抑制了膳食胆碱诱导的巨噬细胞泡沫细胞的形成。

(2)TMAO改变胆汁酸代谢、减小胆汁酸池

现已证明TMAO可改变胆汁酸代谢来促进动脉粥样硬化[12]。胆汁酸是胆固醇分解代谢的最终产物，胆汁酸在肝脏中合成，释放到近端肠道，再在远端肠道重吸收[13]。由胆固醇合成胆汁酸的限速步骤是由胆固醇7α羟化酶(CYP7A1)催化的[14]。通过对饮食中添加TMAO的小鼠研究发现，TMAO可通过下调CYP7A1表达来减少胆汁酸合成。同时，通过测量发现小鼠的总胆汁酸池减小，多种肝脏胆汁酸转运蛋白如Oatp1、Oatp4、Mrp2、Ntcp的表达减少[15]。法尼酯X受体(FXR)是一种主要的胆汁酸感受器，在调节胆汁酸稳态方面发挥作用，也可通过调节胆汁酸稳态相关基因的转录，保护肝脏免受胆汁酸的毒性。FXR缺陷的小鼠不能适应饮食中的胆酸超载，并表现出血脂异常，血清胆固醇和甘油三酯浓度升高[16,17]。FXR可通过FGF15/19依赖的机制[18]，抑制CYP7A1，减少胆汁酸合成。另外，BA池也可通过法尼醇X受体(FXR)介导的途径上调FMO3的表达。

(3)TMAO影响胆固醇代谢

Koeth等[12]研究发现，给予小鼠TMAO饮食，可抑制小鼠肠道NPC1-L1及ABCG5/8(NPC1-L1：促进胆固醇由肠腔内转运到肠细胞内吸收，ABCG5/8：促进胆固醇由肠细胞转运入肠腔内排泄)的表达，使胆固醇排泄减少，促进动脉粥样硬化的进展。

抑制胆固醇逆向转运：外周游离胆固醇(包括泡沫细胞和血管内皮细胞中的胆固醇)由HDL负载，被酯化为胆固醇酯(CE)，经HDL的转运到达肝细胞后代谢成为胆汁，随粪便排出体外，这一过程被称为高密度脂蛋白(HDL)的胆固醇逆向转运(RCT)[19]，通过受体(ABCA1，ABCG1，SR-B1)来介导。胆固醇可经肝胆途径排泄，即肝脏合成的HDL分泌无脂载脂蛋白(lipid-free apolipoprotein ，(apo) A-1)，ABCA1 调节细胞内胆固醇到ApoA1的转运，形成新生HDL，在胆固醇酯转移蛋白(CETP)等参与下，最终被酯化为成熟HDL。在肝脏中，SR-B1选择性摄取HDL上的CE，转化为胆汁酸，通过肠道经粪便排出体外。通过实验发现，给予TMAO饮食的小鼠，RCT降低了35%，这表明TMAO可通过抑制HDL介导的RCT来加重动脉粥样硬化。除了上述主要的肝胆胆固醇清除途径外，近年来，另一种称为非胆道肠内胆固醇输出(TICE)途径也被发现，其可促进胆固醇从血液通过肠细胞直接转移到肠腔[20]。TICE流失的胆固醇占总胆固醇排泄的30%[21]，基于对FMO3基因敲除小鼠进行的实验，发现FMO3损害胆固醇流入TICE途径[22]。

TMAO改变胆汁酸谱：胆汁酸可以分为初级胆汁酸和次级胆汁酸。在肝脏中合成初级胆汁酸，如胆酸(CA)、脱氧胆酸(TDCA)、鹅脱氧胆酸(CDCA)，进入肠道后由肠道微生物进一步代谢为次级胆汁酸，如去氧胆酸(DCA)、牛磺酸鹅去氧胆酸(TCDCA)、牛磺酸猪去氧胆酸(THDCA)。其中几种胆汁酸种类，如CDCA及其结合形式，已经被确认为FXR激动剂[23]，研究证明，给予apoE-/-小鼠TMAO喂养8周后，通过LC-MS测定了肝脏、胆汁和血清中的胆汁酸分布，胆汁中THDCA和TCDCA的百分比增加，而TDCA和CA的百分比降低，这可能与FXR的激活有关，进而抑制胆汁酸的合成[3]。与胆汁相对应，TMAO可诱导肝脏高THDCA率和低TDCA率。血清标本中，TMAO组THDCA和DCA的检出率均高于对照组。并且与胆汁一样，TMAO也显著降低了血清中CA的比例。TMAO组血清中THDCA的比例增加，TMCA的比例降低，表明饲料中的TMAO容易促进肠道内MCA(FXR的拮抗剂)形成HDCA。据报道，降低TMCAs水平可以促进回肠FXR依赖性FGF15的表达，进而抑制肝脏CYP7A1的表达[24]。因此，胆汁酸组成的改变可能是FXR活化的主要原因，进而通过抑制Cyp7a1的表达而抑制胆汁酸的合成。

已报道的肠道微生物参与形成的代谢产物有上百种，每种代谢产物都可与某种生理功能、病理反应相关联。随着研究的深入，肠道微生物与心血管疾病之间的关系关系越来越明确，肠道微生物代谢产物TMAO可通过多种方式加重动脉粥样硬化。体内TMAO的浓度是由几个主要因素决定的，包括饮食习惯、肠道微生物、FMO3活性、肾功能以及脂质代谢等。其中，TMAO影响胆固醇正常代谢，加重体内胆固醇沉积是一个重要的机制。因此调节饮食结构，减少含胆碱食物摄入、抑制TMA产生、抑制FMO3活性等均可以成为干预策略，也为今后心血管疾病研究提供了新的思路。