阿司匹林联合褪黑素治疗骨质疏松症的实验研究*

陈宣煌，高小强，吴 峰，黃漫为，郑锦清，陈金辉

(1.莆田学院附属医院骨科，福建 莆田 351100；2.莆田学院附属医院康复医学科；3.莆田学院附属医院中医骨伤科)

在中国，骨质疏松症是一种常见病、多发病，其发病率也因为社会逐渐老龄化而逐年不断升高，尤其是绝经后的妇女，其骨质疏松症和骨折并发症发病率更高，是男性的8倍，原发性骨质疏松已经成为世界性健康问题[1-3]。目前临床多采用药物治疗，但大部分药物均存在较大不良反应及价格昂贵等缺点，百年老药阿司匹林近几年被研究证明有显著改善老年人骨质密度的新功能，且作为一种长期临床应用的药物，副作用小，价格低[4]。最近有学者研究[5]发现褪黑素不仅能够参与机体生物体温、免疫功能、心血管发育等，还具有抗衰老抗氧化的作用，且还能促进骨的形成，增加骨量。尤其是女性，随着年龄的增长，血清中的褪黑素水平明显下降，骨质疏松的发生率也明显升高[6-7]。本研究通过将阿司匹林、褪黑素单独和联合应用于大鼠骨质疏松症治疗，观察其治疗效果，从而为临床治疗提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 实验组别

选择100只3月龄SD雌性大鼠，按照随机生成数字的方法分成A组：假手术组(Sham组)，B组：卵巢切除组(OVX组)，C组：单纯阿司匹林组(OVXa组)，D组：单纯褪黑素组(OVXm组)，E组：阿司匹林+褪黑素组(OVXam组)；每组20只。分术后8周、12周两个时间段，每个时间段每组各10只。

1.2 动物模型建立和干预方法

骨质疏松模型建立[8]和鉴定：B、C、D、E组大鼠在无菌状态下行双侧卵巢切除术：大鼠腹腔内注射40mg/kg戊巴比妥钠，麻醉生效后，俯卧位固定在动物手术操作台上。背部双侧季肋区剃毛，碘酒、酒精消毒后，取后背正中纵行切口长约1.5cm，分离软组织及肌层寻找卵巢，其标志是卵巢周围的脂肪组织，显露并结扎、切除卵巢。逐层缝合至皮肤，同法处理对侧卵巢。为了鉴定模型制备是否成功，在卵巢切除术时切取的组织进行HE染色光镜观察鉴定分析。动物饲养条件符合国家级卫生标准，自然光照周期，自由进食水。室温17℃～21℃，12～12h间隔照明，定期紫外线消毒与排风。Sham组除未行结扎切除卵巢外，其它步骤同OVX组。干预方法：确认模型建立成功后给药途径阿司匹林、生理盐水为灌胃，褪黑素为静脉注射。药物治疗组剂量分别为C组：单纯阿司匹林8.93mg/(kg·d)，D组：单纯褪黑素10mg/(kg·d)，E组：阿司匹林 8.93mg/(kg·d)+褪黑素10mg/(kg·d)，每天灌胃1次，OVX及Sham组每天予等量生理理盐水灌胃，药物干预至动物处死。

1.3 检查指标及检验方法

1.3.1 骨代谢指标检测

进行大鼠腹主动脉抽血收集血标本，血清骨转化标志物检测均是采用酶联免疫法，指标包括I型胶原C端交联肽(C-terminal cross-linked telopeptides of type I collagen，CTX)和骨钙素(osteocalcin，OC)。检测前所有的大鼠均采用2%戊巴比妥钠进行麻醉，麻醉方式是通过腹腔注射，麻醉后进行心脏穿刺然后采集6～8mL血液，然后静置1h后，离心获得上清，离心条件为：温度4℃，转速3000rpm，时间为10min，将血清放置在-80℃冰箱中进行保存，统一检测。

1.3.2 骨密度检测

切取大鼠腰椎标本，将肌肉、韧带等非骨质部分刮除干净后，以生理盐水纱布围裹、密封，保存于-20℃冰柜中。用双能X线吸收骨密度测量仪(DXA)测量第三腰椎骨密度。

1.3.3 骨生物力学测试

标本处理：麻醉下将大鼠处死，右胫骨取材以生理盐水纱布围裹，封存于-20℃冰柜内。采用三点弯曲力学测试，获取胫骨近端骨的最大弯曲应力(F max N)。

1.3.4 骨结构检测

左侧胫骨标本进行Micro-CT分析骨微细结构：大鼠麻醉处死后，取大鼠左侧胫骨，用浓度为80%的酒精固定。调节Micro-CT至大鼠胫骨标本近端骺板下2mm和远端2mm之间感兴趣区域的松质骨进行扫描。获得断层扫描图像后，进行三维重建，注意把骨皮质影像去除，然后采用软件进行自动定量分析。获得并记录骨小梁数量(trabecular number，Tb.N)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)、骨小梁间隔(trabecular separation/spacing，Tb.Sp)、结构模型指数(structure model Index，SMI)、连接密度(connective density，Conn.D.)、相对骨体积(BV/TV)各参数数值。

1.4 统计学方法

应用SPSS 21.0软件统计分析所得数据，以均数±标准差记录计量资料，应用t检验进行组间两独立样本统计比较，应用单向方差分析(One-way ANOVA)进行多组间独立样本统计比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 骨代谢指标检测

与Sham组比较，OVX组里在本实验不同时间点OC减低、CTX指标显著性提高；OVXa、OVXm、OVXam组的OC较OVX逐渐升高，每组组内术后12周又比术后8周有所升高，OC指标OVX、OVXa、OVXm、OVXam各组逐渐增高，有统计学意义(P均<0.05)。OVXa、OVXm、OVXam组的CTX较OVX逐渐降低，每组组内术后12周又比术后8周有所降低，OVX、OVXa、OVXm、OVXam各组逐渐减低，有统计学意义(P均<0.05)。见表1。

表1 不同组骨代谢指标比较

2.2 骨密度检测

术后8周及术后12周，5组之间两两均有差异，骨密度均OVX

表2 不同组术后8周及术后12周骨密度检测

2.3 骨的生物力学检测

术后8周及术后12周，5组之间两两均有差异，均OVX

表3 不同组术后8周及术后12周骨的生物力学检测

2.4 骨结构检测

术后12周后，5组骨结构各项指标均为OVX

表4 术后12周不同组骨结构检测

3 讨 论

骨质疏松作为一种严重威胁人类生命健康的疾病，发病率逐年增加，且骨质疏松症还会引起骨折。在我国，老年女性占绝大部分，且更年期后，女性骨量流失出现加快。加之雌激素降低、生长因子减少、糖尿病、甲亢、滥用激素类药物等均会引起骨质疏松，因此，预防和治疗骨质疏松尤为重要[9-11]。

国外学者[12]研究显示每天服用300mg的阿司匹林，12个月后采用CT检查显示骨密度较治疗前明显提高，且其研究认为长期规律性服用阿司匹林可以明显改善妇女骨密度。褪黑素作为松果体分泌的吲哚类激素，在机体生理过程中扮演着重要角色，譬如增加免疫力、清除自由基、抗炎和抗衰老等。目前临床多采用阿司匹林治疗骨质疏松，但单一用药对患者的改善有限，因此，本研究考虑联合用药，观察联合用药在骨质疏松症中的治疗效果，结果显示骨代谢指标与Sham组比较，OVX组里在本实验不同时间点OC减低、CTX指标显著性提高；OVXa、OVXm、OVXam组的OC较OVX组逐渐高，每组组内术后12周又比术后8周有所升高，OC指标OVX、OVXa、OVXm、OVXam各组逐渐增高，有统计学意义(P均<0.05)。OVXa、OVXm、OVXam组的CTX较OVX组逐渐降低，每组组内术后12周又比术后8周有所降低，OVX、OVXa、OVXm、OVXam各组逐渐减低，有统计学意义(P均<0.05)。骨密度及骨的生物力学检测结果显示术后8周及术后12周，5组之间两两均有差异，均OVX

综上所述，阿司匹林和褪黑素联合应用治疗骨质疏松症，可以明显改善骨代谢、骨密度、骨的生物力学和骨结构指标。